松針層孔菌的質量標準研究

汪瑾雨 余海立 茍保靈 汪鋆植 劉蘭慶 賀海波 鄒 坤

(天然產物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學) & 湖北省土家族藥物研究所, 湖北 宜昌 443002)

松針層孔菌為多孔菌科針層孔菌屬大型真菌[Phellinuspini(Thore：Fr.)Ames.]的干燥子實體，別名松木層孔菌、松白腐菌、黃芝、松針林芝、紅緣樹舌等[1-2]．分布于東北、河北、山西、甘肅、四川等地．常生長于針葉樹的樹干或朽木上．研究表明其具有抗腫瘤、調節免疫、降血糖等藥理作用[3-5]．松針層孔菌在我國有悠久的藥用歷史，《神農本草經》曾記載[6]：黃芝，味甘、平．主治心腹五邪，益脾氣，安神，忠信和樂．久食輕身，不老延年．近年來松針層孔菌的應用增加，但缺乏質量標準．同時，市場上有松針層孔菌與同屬的火木層孔菌(Phellinusigniarous)和裂蹄木層孔菌(Phellinuslinteus)等混用的現象．為了有效控制松針層孔菌的質量，更好地開發利用該藥物資源，本文對松針層孔菌藥材的質量標準進行了研究．

1 儀器與試劑

儀器：Dionex U3000型高效液相色譜儀(美國戴安液相色譜有限公司)；UV-3100PC紫外-可見分光光度計(上海嘉鵬科技有限公司)；ME215S型十萬分之一電子天平(德國Sartorios公司)；SincoFE 130型藥物粉碎機(河北黃驊市航天儀器廠)；KQ-700DV型數控超聲波清洗器(上海書培實驗設備有限公司)；ZF-1型三用紫外線分析儀(上?；茖嶒炂鞑挠邢薰?；Nikon DS-Fil顯微鏡；硅膠G預制薄層板(青島譜科分離材料有限公司)．

試劑：Hispolon對照品(批號：ALX-350-384-M025)購自Alexis公司．超純水；色譜純的甲醇、乙腈；其余試劑均為分析純．實驗用松針層孔菌樣品由湖北天濟中藥飲片有限公司提供，由三峽大學王玉兵博士鑒定為松針層孔菌[Phellinuspini(Thore：Fr.)Ames]．

2 方法與結果

2.1 藥材性狀

子實體多年生，木質．菌蓋呈扁半球形、馬蹄形或貝殼狀，無柄．長7～25 cm，少數可達40 cm，寬4～15 cm，厚2～20 cm．蓋面呈黃棕色至褐色，角質化．菌體具同心環紋，常龜裂，邊緣鈍，紅棕色至棕褐色．菌肉淺咖啡色至深咖啡色，厚1～6mm．菌管與菌肉同色、內部灰白色，多層，每層厚2～6 mm，管壁厚；管口多角形至迷宮狀，每毫米1～3個．孢子近球形，光滑，無色至淡褐色．味苦．如圖1所示．

圖1 松針層孔菌藥材

2.2 顯微特征

本品粉末黃褐色至黑色，菌絲無色至黃褐色，散在或粘結成團，細長，稍彎曲，少有分枝，直徑3.0～5.0 μm．孢子橢圓形或卵圓形，表面平滑．長3.1～6.5 μm，寬2.0～4.5 μm．如圖2所示．

1.菌絲；2.孢子圖2 松針層孔菌粉末圖(×400)

2.3 檢查[7]

參照2015年版中國藥典四部通則0832第二法測定水分．參照2015年版中國藥典四部通則2302法測定總灰分、酸不溶性灰分．參照2015年版中國藥典四部通則2201熱浸法測定水溶性浸出物及醇溶性浸出物．結果見表1．

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取適量的Hispolon對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的對照品溶液．

2.4.2 供試品溶液的制備

精密稱取3.0 g的松針層孔菌藥材粉末(過二號篩)，加入50 mL甲醇，加熱回流提取3次，每次60 min，過濾，濾液濃縮至10 mL，即得．

2.4.3 條件與結果

于室溫(20～25℃)條件下，參照薄層色譜法(2015年版中國藥典通則0502)，吸取供試品和對照品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，石油醚-乙酸乙酯-丙酮(0.8∶1∶0.3)作為展開劑進行展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，然后以5%磷鉬酸溶液加熱顯色至斑點清晰．供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點．結果如圖3所示．

2.5 Hispolon含量測定

2.5.1 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫30℃；流動相為乙腈-水(35∶65)；進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長為365 nm．理論板數按Hispolon對照品計不低于3 000．該色譜條件下，Hispolon與其他各組分達到良好的分離效果．在此條件下測得Hispolon對照品及供試品HPLC色譜圖，如圖4所示．

2.5.2 對照品溶液的制備

精密稱取10.0 mg的Hispolon對照品，加甲醇定容至10 mL，即得濃度為1.000 mg/mL的對照品溶液．

2.5.3 供試品溶液的制備

精密稱取3.0 g松針層孔菌藥材粉末(過二號篩)，加入50 mL甲醇，加熱回流提取3次，每次60 min，過濾，濾液濃縮定容至10 mL，即得．

2.5.4 線性關系考察

精密吸取“2.5.2”項制備的對照品溶液，用甲醇稀釋配制成系列質量濃度：125、200、250、500、1 000 μg/mL，按“2.5.1”項下色譜條件進樣分析，以質量濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積積分值(y,mAU)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=250.88X-3.537 1(r=0.999 9)．結果表明，Hispolon進樣量在125～1 000 μg/mL范圍內線性關系良好．

2.5.5 精密度試驗

精密吸取Hispolon對照品10 μL，連續6次進樣分析，結果Hispolon峰面積的RSD為0.96%．結果表明儀器精密度良好．

2.5.6 穩定性試驗

于0、2、4、6、8、10 h精密吸取同一供試品溶液，按“2.5.1”項進樣分析，測定峰面積，計算Hispolon峰面積的RSD為1.67%．表明供試品溶液在10 h內穩定．

2.5.7 重復性試驗

取6份3.0 g的同一批次松針層孔菌藥材粉末(過二號篩)，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備，“2.5.1”項下進樣分析，記錄峰面積，計算Hispolon含量的RSD為1.93%，表明方法重復性較好．

2.5.8 加樣回收率試驗

取6份2.0 g的同一批次松針層孔菌藥材粉末(過二號篩)，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備，分別精密加入一定量的Hispolon對照品溶液，“2.5.1”項下進樣分析，計算平均加樣回收率．結果，平均加樣回收率為99.84%，RSD為1.28%．

2.5.9 樣品含量測定

取10批松針層孔菌樣品，按“2.5.3”項下方法制成10份樣品溶液，“2.5.1”項進樣分析，測定峰面積，根據線性回歸方程計算樣品中Hispolon的含量．結果見表2．

表2 10批松針層孔菌中Hispolon含量(%)

2.6 總酚測定

2.6.1 測定波長的選擇

取對照品和供試品溶液于紫外-可見分光光度計的190～500 nm范圍內進行掃描，以甲醇為空白，結果如圖5所示．結果表明，對照品和供試品溶液均在365 nm處有最大吸收峰，故選擇365 nm作為測定波長．

圖5 對照品(a)和松針層孔菌樣品(b)紫外光譜圖

2.6.2 線性關系考察

將“2.5.2”項的對照品溶液用甲醇稀釋配制成系列質量濃度：250、400、550、700、850、1 000 μg/mL，于365 nm處測定吸光度．以Hispolon質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.201 8X-0.193 6(r=0.999 1)．結果表明，Hispolon進樣量在250～1 000 μg/mL范圍內線性關系良好．

2.6.3 精密度試驗

取Hispolon對照品于365 nm處測定吸光度，重復測定6次，結果RSD為0.26%．結果表明儀器精密度良好．

2.6.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、10 h取樣于365 nm處測定吸光度，結果RSD為0.87%．結果表明供試品溶液在10 h內穩定．

2.6.5 重復性試驗

取同一批松針層孔菌樣品6份，按“2.5.3”項下方法制備，于365 nm處測定吸光度，測得總酚平均含量為2.38 mg/g，RSD為0.34%．結果表明方法重復性良好．

2.6.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知總酚含量的松針層孔菌樣品6份，加入等量的對照品，按“2.5.3”項下方法制備，于365 nm處測定吸光度，結果平均加樣回收率為98.92%，RSD為1.69%．

2.6.7 樣品總酚含量測定

取“2.5.9”項制備的10份供試品溶液于365 nm處測定吸光度，計算樣品中總酚的含量．結果見表3．

表3 10批松針層孔菌中總酚含量(以Hispolon計)(%)

3 討 論

酚類化合物Hispolon為層孔菌中共有的活性成分[8-9]，研究表明Hispolon具有抗炎、抗增殖、抗氧化等多種活性[10-12]．同時，還具有抑制多種癌癥細胞生長于或轉移的抗癌作用，其作用機制是通過線粒體介導的細胞凋亡、抑制轉移等多種途徑實現的[13-16]．這種抑制作用只對癌細胞有影響，由此可見，Hispolon具有較好的應用價值．因此，以Hispolon為指示成分，控制松針層孔菌有效成分含量．但Hispolon含量低，為了更好控制質量，本文進一步測定了總酚含量．

研究詳細描述了松針層孔菌藥材的性狀和顯微特征，能較好地和同屬其他真菌相區分．根據測定結果，Hispolon的平均含量為0.0160%，擬定Hispolon的含量不得低于0.01%；水分含量測定結果為11.48%～12.11%，擬定水分不得過13.0%；總灰分量為1.74%～1.89%，擬定總灰分不得過2.0%；酸不溶性灰分量為0.54%～0.64%，擬定酸不溶性灰分不得過1.0%；水溶性浸出物量為2.81%～3.66%，擬定水溶性浸出物不得低于2.0%；醇溶性浸出物量為4.34%～5.75%，擬定醇溶性浸出物不得低于4.0%．同時以Hispolon為對照，測定樣品中總酚的平均含量為0.238%，擬定總酚的含量不得低于0.20%．根據研究結果擬定的“松針層孔菌藥材質量標準”擬收載入《湖北省中藥材質量標準》(2017年版)，為控制松針層孔菌藥材質量提供了法定依據．

薄層色譜中嘗試了石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯-甲醇、石油醚-乙酸乙酯-丙酮等展開體系，經過不斷調試，最終確定合適的展開劑，即石油醚-乙酸乙酯-丙酮(0.8∶1∶0.3)為展開體系，該展開劑分離效果好，Rf值較適中，故選該條件展開，置紫外光燈(365nm)下檢視，被檢成分熒光斑點清晰．此外，分別于室溫(20～25℃)、高溫(28～30℃)及低溫(9～15℃)條件下展開，結果顯示，在室溫(20～25℃)時能獲得較好的分離效果．

研究首次對松針層孔菌藥材的質量進行了系統研究，制定了質量標準，為其質量控制提供了可控指標．但是，松針層孔菌可能含有多種活性成分．因此，不同活性成分的含量及其與質量的關系有待進一步研究，以便更好地控制松針層孔菌的質量．

[1] 黃年來．中國大型真菌原色圖鑒[M]．北京：中國農業出版社，1998：73．

[2] 馮強生．松木層孔菌發酵工藝優化及其抗腫瘤活性成分研究[D]．杭州：浙江大學,2012．

[3] 李 聰，邱麗麗，張永清.針層孔菌屬真菌生物活性研究進展[J]．中華中醫藥學刊，2009，27(7)：1484-1487．

[4] 牟玥靜，方 磊，李 佳，等．藥用真菌針層孔菌屬生物活性研究進展[J]．遼寧中醫藥大學學報，2016，18(4)：82-85．

[5] 祁銀德，吳夢瑛，申 茹．松木層孔菌研究進展[J]．中國林副特產，2015(6)：83-85．

[6] 陶弘景．本草經集注[M]．1版．北京：人民衛生出版社，1994：185．

[7] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典[S]．四部．北京：中國醫藥科技出版社，2015．

[8] 陶美華，章衛民，鐘 韓，等．針層孔菌屬(Phellinus)中藥用真菌的研究概述[J]．食用菌學報，2005，12(4)：65-72．

[9] 秦春華，武 玲，汪鋆植，等．9種桑黃子實體中兩種酚類活性成分的HPLC含量測定[J]．湖北中醫藥大學學報,2015(3)：36-39．

[10] Kim J H，Kim Y C，Park B．Hispolon fromPhellinusLinteusInduces Apoptosis and Sensitizes Human Cancer Cells to the Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand Through Upregulation of Death Receptors[J]．Oncology Reports，2016，35(2)：1020．

[11] Toopmuang P，Khamchum C，Punsuvon V． Detection and Confirmation of Hispolon in the MushroomPhellinusLinteus[J]．Scienceasia，2014，40(2)：141．

[12] Guan-Jhong Huang， Jeng-Shyan Deng， Chuan-Sung Chiu，et al. Hispolon Protects Against Acute Liver Damage in the Rat by Inhibiting Lipid Peroxidation，Proinflammatory Cytokine，and Oxidative Stress and Downregulating the Expressions of iNOS，COX-2，and MMP-9[J]．Evidence-based Complementary and Alternative Medicine ： eCAM，2012，2012(1741-427X)：480714．

[13] Zhao Z， Sun Y S， Chen W， et al. Hispolon Inhibits Breast Cancer Cell Migration by Reversal of Epithelial-to-mesenchymal Transition Via Suppressing the ROS/ERK/Slug/E-cadherin Pathway[J]．Oncology Reports，2016，35(2)：896．

[14] Huang G J，Yang C M，Chang Y S，et al. Hispolon Suppresses SK-Hep1 Human Hepatoma Cell Metastasis by Inhibiting Matrix Metalloproteinase-2/9 and Urokinase-plasminogen Activator Through the PI3K/Akt and ERK Signaling Pathways.[J]．Journal of Agricultural & Food Chemistry，2010，58(17)：9468．

[15] Tsai H H，Lee W R，Wang P H，et al. Propioni Bacterium Acnes-induced iNOS and COX-2 Protein Expression via ROS-dependent NF-κB and AP-1 Activation in Macrophages[J]．Journal of Dermatological Science，2013，69(2)：122-13．

[16] Chen W，Zhao Z，Li L，et al. Hispolon Induces Apoptosis in Human Gastric Cancer Cells Through a ROS-mediated Mitochondrial Pathway[J]．Free Radical Biology & Medicine， 2008，45(1)：60.