珠子參皂苷脂質體凝膠劑的制備及皮膚毒性實驗研究

張繼紅 王海燕 李小妹 石孟瓊 李小琴 張永峰 陳茂華 劉宏軍 羅 濤 鄒 坤

(1. 三峽大學 中醫臨床醫學院/三峽大學 脾胃病研究所，湖北 宜昌 443002； 2. 三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002； 3. 三峽大學 醫學院，湖北 宜昌 443002)

作為新型膠體給藥系統的脂質體，由于其良好的生物相容性，靶向性和膜通透性的可控性，有助于藥物迅速穿透皮膚，聚集在作用部位，形成藥物儲庫而維持較為恒定的有效血藥濃度，發揮緩釋及降低不良反應的作用[1]．凝膠劑具有較好的延展性和生物粘附性，外用可直接從給藥部位吸收，避免了肝臟的首過效應．近年來，將兩者結合制備成脂質體凝膠在外傷、皮膚疾病和護膚美容治療等方面得到了廣泛的應用．

五加科人參屬植物珠子參(Panacismajorisrhizoma)為土家民間習用草藥．其味苦、甘，微寒，歸肝、肺、胃經，具有散瘀止血，活血定痛，解毒消腫等功效，主治咯血、吐血、衄血、尿血、便血，崩漏、產后出血過多、瘀血腹痛、經閉，跌打瘀腫、外傷出血、瘡瘍腫毒等[2-4]．對其化學成分研究表明，珠子參皂苷為其重要的活性成分之一．近年來，先后從珠子參中分離出其皂苷成分，并證實其具有散瘀活血、消腫定痛和清熱解毒之功，對急慢性軟組織損傷和創傷性炎癥具有非常顯著的療效[5]．在制成醫院制劑應用過程中發現，珠子參皂苷極性較大，雖然在水中溶解性較好，但是由于與皮膚相容性低，如果將其直接制成傳統的制劑外用很難較快穿透皮膚，發揮其療效．基于此，本文旨在制備一種含有珠子參皂苷的脂質體凝膠，以提高珠子參皂苷在皮膚中的滯留量和吸收效果；通過對珠子參皂苷脂質體凝膠的急性毒性、皮刺激性和過敏性實驗研究，評價其皮膚用藥的安全性．

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

珠子參皂苷的制備方法見文獻[5]，實驗制得珠子參皂苷的淡棕色粉末，經HPLC檢測含量為92.65%．

1.2 動物

體質量為2.0～2.5 kg的健康新西蘭大白兔40只，雌雄各半，購自三峽大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(鄂)2011-0012；體質量280～300 g的健康成年豚鼠30只，雌雄各半，購自三峽大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(鄂)2011-0012．動物飼養環境：溫度23℃±3℃，相對濕度55%±15%，光照晝夜交替的房間內，自由飲水和攝食．

1.3 試劑

卵磷脂(日本丘比株式會社，批號：EK10028)；膽固醇(上?；瘜W試劑公司，批號：D12260234)；卡波姆-940(上海人民制藥廠，批號：BJ14417)；硫化鈉(天力化學試劑公司，批號：20150824)；甲醛(天力化學試劑公司，批號：20150916)；2,4-二硝基氯苯(上?；瘜W試劑廠，批號：20150719)；其他試劑為國產分析純．

1.4 儀器

XSE104電子分析天平、pH計(梅特勒-托利多國際股份有限公司)；超聲清洗機(濟寧金百特電子有限責任公司)；旋轉蒸發儀(日本EYELA)；恒溫箱(南京實驗儀器廠)；XPE10001L電子秤(梅特勒-托利多國際股份有限公司)；5810臺式高速離心機(德國eppendorf公司)；ZRS-4智能溶出儀(天津大學無線電廠)；組織切片機(德國Leica公司)；顯微圖像采集及分析系統(德國Leica公司)．

1.5 方法

1.5.1 珠子參皂苷脂質體的制備

稱取卵磷脂0.4 g、膽固醇0.4 g和珠子參皂苷2.0 g溶于80 mL氯仿中，緩慢加入磷酸鹽緩沖液20 mL，冰浴條件下探頭超聲6次，每次5 min，得到均勻乳劑，然后轉入圓底燒瓶中，用旋轉蒸發儀回收氯仿，再加入60 mL磷酸鹽緩沖液，置于超聲儀中超聲45 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得．

1.5.2 珠子參皂苷脂質體凝膠的制備

分別取甘油5.0 g、卡波姆-940 4.0 g，加入適量蒸餾水中，待充分溶脹后加入制備好的珠子參皂苷脂質體80 mL，滴加2 mol/L的NaOH溶液適量調節pH在6～7之間，加蒸餾水定容至200 mL，攪拌均勻即得，其珠子參皂苷含量為1.0%．

1.5.3 珠子參皂苷脂質體包封率分析[6]

取脂質體2 mL置于10 mL離心管中，用純化水定容至6 mL，15 000 rpm/min離心90 min，分離上清液和沉淀物，然后用異丙醇破壞脂質體并定容至10 mL，在310 nm波長處測定它們的吸光度，計算上清液和沉淀物中珠子參皂苷的量，然后計算珠子參皂苷脂質體的包封率[包封率(%)=(沉淀中珠子參皂苷的量)/(上清液中珠子參皂苷的量+沉淀中珠子參皂苷的量)×100%]．

1.5.4 珠子參皂苷脂質體凝膠體外釋放度測定[7]

將稱量好的1.0 g珠子參皂苷脂質體凝膠和珠子參皂苷凝膠分別置入透析袋中，密封好后，浸沒在500 mL，pH為6.5的磷酸鹽緩沖液透析介質中，在37℃的循環水浴中，轉速為50 rpm/min，于0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和24.0 h時間點取樣1.0 mL．每次取樣后，補加等量磷酸鹽緩沖液透析介質．取樣液測定吸光度(吸收波長為310 nm)，分別計算珠子參皂苷的釋放量；用同樣的方法測定珠子參皂苷凝膠的釋放量．

1.5.5 珠子參皂苷脂質體凝膠初步穩定性實驗[8]

1)溫度實驗．準確稱量3批珠子參皂苷脂質體凝膠劑樣品27份，分別密封于5.0 mL棕色玻璃瓶中，然后置于20、40、60℃恒溫干燥器中保存，分別于第0、5、10天取出，觀察其外觀，隨后依照“1.5.3”的方法測定其包封率．

2)光照實驗．準確稱量3批珠子參皂苷脂質體凝膠劑樣品9份，分別密封于5.0 mL無色玻璃瓶中，然后置于照度為4 000 LX的條件光照，分別于第0、5、10 d取出，觀察其外觀，隨后依照“1.5.3”的方法測定其包封率．

3)濕度影響試驗．準確稱量3批珠子參皂苷脂質體凝膠劑樣品18份，分別密封于5.0 mL無色玻璃瓶中，然后分別置于相對濕度(RH)分別為75%和92.5%，恒溫25℃條件下保存，分別于第0、5、10 d取出，觀察其外觀，隨后依照“1.5.3”的方法測定其包封率．

4)pH值測定．準確稱量3批珠子參皂苷脂質體凝膠劑樣品9份，分別密封于5.0 mL無色玻璃瓶中，然后恒溫25℃條件下保存，分別于第0、5、10 d取出，置于燒杯中，加純化水均勻攪拌后，用pH計測定其pH值．

1.5.6 皮膚急性毒性實驗[9-11]

將新西蘭大白兔隨機分為完整皮膚組和破損皮膚組兩大組，完整皮膚組分為：基質對照組、珠子參皂苷脂質體凝膠劑低劑量組(為臨床用藥藥量60倍)、珠子參皂苷脂質體凝膠劑高劑量組(為臨床用藥藥量120倍)；破損皮膚組分為：基質對照組、珠子參皂苷脂質體凝膠劑低劑量組(為臨床用藥藥量60倍)、珠子參皂苷脂質體凝膠劑高劑量組(為臨床用藥藥量120倍)．每組4只，雌雄各半，共計24只．完整皮膚組先用剃毛剪剪去背部脊柱兩側對稱的毛發后，用8%硫化鈉溶液脫去未剃凈毛發，脫毛面積為160 cm2(相當兔體表面積的10%)；破損皮膚組在脫毛后，先用75%酒精消毒，然后用400號的紗布紙將脫毛部位摩擦造成局部擦傷，以滲血為度．給藥組將珠子參皂苷脂質體凝膠(6 g或12 g)分別均勻涂抹于正常皮膚和破損皮膚的低、高劑量組，然后用醫用滅菌紗布固定，12 h后再涂布1次，實驗動物分籠單獨飼養；完整皮膚和破損皮膚基質對照組則涂抹不含珠子參皂苷的脂質體凝膠，其余處理方法同給藥組．給藥24 h后取下包扎紗布，用消毒棉簽擦去皮膚上的凝膠，然后用滅菌溫水清洗皮膚．每天觀察和記錄兔的一般狀況，具體包括體質量、涂藥皮膚紅腫程度、毛發、眼睛及活動情況．若遇兔死亡，則及時尸檢和進行肉眼觀察，并進行病理形態學分析．給藥后的第8 d，分別取涂藥部位的皮膚，用4%多聚甲醛固定后，包埋切片，經HE染色后進行皮膚組織形態學分析．

1.5.7 皮膚刺激性實驗

1)單次給藥皮膚刺激性實驗．選取8只雌雄各半的健康新西蘭大白兔，按體質量隨機分為基質對照組和珠子參皂苷脂質體凝膠劑組，每組4只．實驗前，兩組兔剃毛方法同1.5.6所述(左側皮膚脫毛后，先用75%酒精消毒)．剃毛后的次日，兩組兔的左右兩側的破損和正常皮膚分別涂抹不含珠子參皂苷的脂質體凝膠和含珠子參皂苷的脂質體凝膠(為臨床用藥藥量120倍)，然后用醫用滅菌紗布固定，6 h后，用滅菌溫水清洗皮膚分別于停藥后1、24、48和72 h肉眼觀察涂抹部位的紅斑、水腫等情況，并按文獻介紹的方法[9-12]進行皮膚刺激反應評分和刺激強度評價．

2)多次給藥皮膚刺激性實驗．選取8只雌雄各半的健康新西蘭大白兔，分組及制作破損皮膚方法同“單次給藥皮膚刺激性實驗”，剃毛后的次日，兩組兔的左右兩側的破損和正常皮膚分別涂抹不含珠子參皂苷的脂質體凝膠和含珠子參皂苷的脂質體凝膠(為臨床用藥藥量120倍)，然后用醫用滅菌紗布固定，每天1次，連續用藥7 d，末次給藥24 h后，用滅菌溫水清洗皮膚分別于停藥后1、24、48、72 h肉眼觀察涂抹部位的紅斑、水腫等情況，并按文獻介紹的方法[9-12]進行皮膚刺激反應評分和刺激強度評價．

1.5.8 皮膚過敏性實驗

選取健康的成年豚鼠30只，體質量為280～300 g，雌雄各半，按體質量和性別完全隨機分為不含珠子參皂苷的脂質體凝膠對照組、珠子參皂苷的脂質體凝膠組和2,4-二硝基氯苯組．實驗前剃毛剪剪背部脊柱兩側對稱的毛發后，用8%硫化鈉溶液脫去未剃凈毛發，脫毛面積為9 cm2，剔除因剃毛引起皮膚受損的豚鼠．①致敏接觸：剃毛24 h后3組實驗豚鼠分別涂抹相應的藥物，脂質體凝膠組和珠子參皂苷的脂質體凝膠組涂抹的量為0.2 g/只，2,4-二硝基氯苯組為1% 2,4-二硝基氯苯0.2 mL/只，然后依次用油紙和紗布覆蓋，無刺激膠布固定，處理完后的豚鼠分籠單獨飼養，6h后用滅菌溫水洗皮膚上涂抹的藥物．第7 d和第14 d用同樣的方法分別重復1次．②激發接觸：于末次致敏接觸后14 d，3組實驗豚鼠的左側剃毛皮膚分別涂抹0.1% 2,4-二硝基氯苯0.2 mL/只，6 h后用滅菌溫水洗去2,4-二硝基氯苯，觀察洗后0、24、48、72 h皮膚的過敏反應情況，計算豚鼠過敏反應平均分值和過敏反應發生率[過敏反應平均分值(分)=(紅斑形成總分+水腫形成總分)/動物例數；過敏反應發生率：過敏反應發生率(%)=出現紅斑和水腫的動物例數/受試動物總數×100%][9-12]．

1.6 數據統計分析

2 結 果

2.1 珠子參皂苷脂質體包封率

通過檢測珠子參皂苷脂質體的平均包封率為：75.8±2.5，符合脂質體制劑的要求(見表1)．

表1 珠子參皂苷脂質體包封率

2.2 珠子參皂苷脂質體凝膠體外釋放度評價

將表2數據進行擬合，其滲透動力學復合Higuchi方程，珠子參皂苷凝膠的滲透方程為y=205.29x1/2+72.54(r=0.981 3)，滲透速率為205.29 μg/mL·h1/2；珠子參脂質體凝膠的滲透方程為y=1347.00x1/2+43.95(r=0.997 8)，滲透速率為1 347.00 μg/mL·h1/2．通過以上分析：珠子參脂質體凝膠在單位時間內的釋藥量和24 h總釋藥量均明顯高于珠子參凝膠．實驗結果表明珠子參皂苷脂質體凝膠的透皮吸收效果優于其凝膠劑．

表2 珠子參皂苷凝膠和脂質體凝膠體外釋放量比較

2.3 珠子參皂苷脂質體凝膠初步穩定性分析

由表3溫度試驗結果可知，珠子參皂苷脂質體凝膠在20、40℃時其淡黃色外觀性狀沒有變化，包封率和pH值變化較??；而在60℃時珠子參皂苷脂質體凝膠劑在5 d時顏色加深，并隨著時間的延長進一步加深和變得渾濁，其包封率降低出現較明顯下降．

表3 珠子參皂苷脂質體凝膠初步穩定性檢測

通過光照試驗結果發現：珠子參皂苷脂質體凝膠在光照條件下，其淡黃色外觀性狀出現明顯加深，而且隨著時間的延長進一步加深和變得渾濁．濕度影響試驗結果表明，該因素對其影響不大．通過次研究，說明該制劑貯存時應室溫和避光保存．

2.4 珠子參皂苷脂質體凝膠對兔皮膚急性毒性的影響

2.4.1 一般狀況觀察

由表4可知，無論脂質體凝膠中是否含有珠子參皂苷對兔完整皮膚和破損皮膚，豚鼠的皮毛光澤度、進食情況、大小便、活動情況及精神狀況等均未見明顯的不良影響．通過比較涂藥前后及涂藥后3 d、7 d的體質量變化，發現脂質體凝膠對照組與對應的珠子參皂苷脂質體凝膠劑組體質量差異無統計學意義(P<0.05)．實驗期間未見兔出現急性毒性反應和兔死亡現象．

表4 珠子參皂苷脂質體凝膠劑對兔體質量和皮膚的影響

與脂質體凝膠對照組比較，*P<0.05，**P<0.01(下同)

2.4.2 珠子參皂苷脂質體凝膠對兔皮膚形態學的影響

通過肉眼觀察發現珠子參皂苷脂質體凝膠對兔完整皮膚無皮膚紅、腫、滲液等不良情況出現，兔的破損皮膚在涂抹珠子參皂苷脂質體凝膠后滲出物減少，隨后開始結痂，4 d后痂脫落；脂質體凝膠對照組兔完整皮膚未見異常，破損皮膚在涂抹脂質體凝膠后前3天未見明顯變化，從第4天開始慢慢結痂(見表4)．

研究證實：珠子參皂苷脂質體凝膠對兔正常皮膚無副作用，對兔破損皮膚能迅速促進皮膚傷口愈合．顯微鏡觀察發現：脂質體凝膠對照組兔的完整皮膚復層上皮細胞完整，毛囊組織和皮下組織結構正常；破損皮膚表皮雖可見新生修復組織，但仍然可見機械性損傷舊痕；復層上皮、毛囊組織和皮下組織形態結構正常．珠子參皂苷脂質體凝膠低、高劑量組的兔完整皮膚復層上皮細胞、毛囊組織結構完整，皮下組織中無白細胞浸潤、組織充血和壞死等情況出現；破損皮膚表皮雖可見新生修復組織，但仍然可見機械性損傷舊痕；復層上皮、毛囊組織和皮下組織形態結構正常．皮下組織中無白細胞浸潤、組織充血和壞死等情況出現(如圖1所示)．

圖1 珠子參皂苷脂質體凝膠對兔皮膚組織形態學的影響(HE染色)

2.5 珠子參皂苷脂質體凝膠對兔皮膚刺激性的影響

2.5.1 兔皮膚單次涂藥對其刺激性影響

由表5可見，兔完整皮膚和破損皮膚單次涂抹脂質體凝膠和珠子參皂苷脂質體凝膠均未出現紅斑、水腫等不良反應．實驗結果表明，珠子參皂苷脂質體凝膠無明顯的皮膚刺激性．

表5 珠子參皂苷脂質體凝膠單次給藥對兔皮膚刺激性的影響(n=4)

2.5.2 兔皮膚多次涂藥對其刺激性影響

由表6可見，兔完整皮膚和破損皮膚多次涂抹脂質體凝膠和珠子參皂苷脂質體凝膠均未現紅斑和水腫．7 d后兩組實驗動物傷口均脫痂愈合，皮膚恢復正常．實驗結果表明，珠子參皂苷脂質體凝膠無明顯的皮膚刺激性．

表6 珠子參皂苷脂質體凝膠多次給藥對兔皮膚刺激性的影響(n=4)

2.6 珠子參皂苷脂質體凝膠對豚鼠皮膚過敏性的影響

由表7可知，2,4-二硝基氯苯組豚鼠剃毛后的完整皮膚和破損皮膚在涂抹2,4-二硝基氯苯0 h有7只出現了非常明顯的紅斑和/或水腫，有3只出現哮喘、2只出現站立不穩的情況；在24 h后9只出現了非常明顯的紅斑和/或水腫，有5只出現哮喘、3只出現站立不穩的情況；48 h后10只均出現了非常明顯的紅斑和/或水腫，有4只出現哮喘、2只出現站立不穩的情況，72 h后仍有7只的紅斑和/或水腫未消退，有2只出現哮喘、1只出現站立不穩的情況．脂質體凝膠對照組和珠子參皂苷脂質體凝膠組豚鼠剃毛后的完整皮膚和破損皮膚在涂藥后均未見紅斑、水腫現象，也無哮喘、站立不穩或休克等全身過敏現象．

表7 珠子參皂苷脂質體凝膠對豚鼠皮膚過敏性的影響(n=10)

3 討 論

珠子參皂苷為珠子參的重要活性成分，具有散瘀活血、消腫定痛和清熱解毒之功，對急慢性軟組織損傷和創傷性炎癥具有非常顯著的療效．在將其制成傳統的軟膏劑、凝膠劑、乳劑等醫院制劑的過程中發現其存在吸收不穩定、局部藥物的生物利用度低等缺點，極大地限制了它的臨床使用．作為新型膠體給藥系統的脂質體，由于其成分和構成人體的細胞膜相似，使得其與人體具有良好的生物相容性，有助于藥物迅速穿透皮膚，聚集在作用部位，形成藥物儲庫而維持較為恒定的有效血藥濃度，在將其制成的醫院制劑的應用過程中證實了這一點．然而在將珠子參皂苷制成醫院制劑應用過程中發現，它雖然在水中溶解性較好，但是由于與皮膚相容性低．在將其制成傳統的軟膏劑、霜劑、凝膠劑應用時，發現其吸收不穩定、局部藥物的生物利用度低．基于此，采用超聲-薄膜分散法制備珠子參皂苷脂質體，以卡波姆-940為基質制備脂質體凝膠，實驗結果顯示制成的珠子參皂苷脂質體凝膠滲透速率顯著高于珠子參皂苷凝膠的滲透速率；初步穩定性試驗表明光和熱對脂質體凝膠的穩定性影響較大，在60℃高溫和光照條件下，珠子參皂苷脂質體凝膠的外觀形狀和包封率明顯下降．因此，珠子參皂苷脂質體凝膠應低溫和避光保存；由于珠子參皂苷脂質體凝膠本身為含水制劑，故濕度對穩定性影響不明顯．

在實驗中，為了保證其臨床應用的安全，進行了珠子參皂苷脂質體凝膠劑的皮膚毒性試驗(急性皮膚毒性、皮膚刺激性和過敏性試驗)．研究表明珠子參皂苷脂質體凝膠在涂抹臨床藥量120倍的劑量時對兔完整和破損皮膚均未見明顯的不良反應，在臨床藥量60倍的劑量時對兔完整和破損皮膚均未產生刺激作用，對實驗豚鼠完整和破損的皮膚也未產生過敏反應．實驗結果表明珠子參皂苷脂質體凝膠經皮給藥治療急慢性軟組織損傷和創傷性炎癥是安全的．本研究為珠子參皂苷脂質體凝膠的開發提供了依據，為擴大其臨床應用提供了新思路．

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