高效液相色譜在多肽分離分析中的應用

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(1.青島大學生物醫用材料與工程研究院，青島大學化學化工學院, 青島 266071；2.纖維新材料與現代紡織國家重點實驗室培育基地，青島大學材料科學與工程學院，青島 266071)

隨著生物化學技術的不斷發展，多肽因其獨特而又高效的吸收機制和非常強的生物活性，而成為生化專家們所關注和研究的熱門材料。由于多肽具有相對低的細胞毒性，具有特異性強、生理活性高和生物功能明確等優勢，且具有信號識別、分子轉導、細胞分化等生理功能[1, 2]，在藥品領域表現出了極其高的應用價值和前景。例如，研究學者通過水解卵黏蛋白從而得到多肽片段，該片段可以用來抑制血細胞的凝集作用；玉米多肽具有防止高血壓，降低膽固醇以及抗疲勞的作用。為了研究多肽的生物活性、物化性質以及醫藥功能，需要高純度的多肽樣品，但是產物的成分一般比較復雜，一般是一個以目標多肽為主的幾種結構類似的多肽混合物，因此多肽的分析、分離和提純就會顯得尤為重要。

而采用何種方法對多肽進行分離分析，是由被測定多肽的性質進行選擇的。目前多肽分離分析常用的方法有：高效液相色譜法、毛細管電泳、核磁共振、飛行時間質譜、鹽析和超濾等。而隨著生物化學技術的發展，傳統的多肽分析分離手段已經不能滿足對大量樣品進行高精確度的分離分析的要求。目前來看，分離效果最好的兩種方法是毛細管電泳法和液相色譜法，而高效液相色譜以其極高的分離效率和良好的選擇性已經成為實驗室以及工業分離分析生物大分子最有效和常用的方法。本文主要介紹了高效液相色譜(HPLC)以及一些新型色譜在多肽分離分析中的應用。

1 高效液相色譜在多肽分析分離中的應用

采用何種方法對所提取的組織或材料進行分離分析，是由所要提取的物質的性質所選擇的。而采用何種方法對多肽進行分離分析，則是由被測定多肽的性質進行選擇的。目前多肽分離分析常用的高效液相色譜的方法有：反相高效液相色譜法、離子交換色譜、體積排擠色譜、疏水作用色譜、親和色譜、多維高效液相色譜、液相色譜與質譜聯用法等。

1.1 反相高效液相色譜

反相高效液相色譜(RP-HPLC)的固定相為表面非極性載體，而流動相為比固定相極性強的溶劑，可以用來分離大多數的可溶于極性溶劑中的有機物,圖1所示為肽鏈與固定相表面疏水基團結合的情況[3]。高楊等[4]采用了C18柱，以0.1%TEA/水和0.1%TEA/乙腈分作為流動相A和B，通過梯度淋洗的方式在反相HPLC模式下對人工合成的布舍瑞林進行了純化，反復純化后使其純度達到98%，純化總收率為50.6%。白泉等[5]采用RP-HPLC對21肽進行了純化，使其純度到達98.6%，并對對樣品組分更為復雜的32肽進行了二次純化，使其純度達到96.4%，并且分別制備了100mg的32肽和21肽。馬安德等[6]優化了RPLC對蛇毒蛋白的分離條件，一次性快速分離蛇毒粗毒組分，并使從蛇毒中分離出來的16組組分的純度都達到了95%以上，其中PLA2的同源物的純度為97.2%。陳兵等[7]采用了凝膠色譜-RPLC-質譜聯用技術對乳酸桿菌代謝出來的混合肽進行了氨基酸序列的測定，對比并驗證了其與Nisin氨基酸序列的不同。呂艷等[8]比較了用于多肽中18種氨基酸的定量分析的最常用的兩種衍生方法，結果表明，步驟簡單的方法有3種氨基酸無法測定，步驟復雜的方法18種氨基酸都可以測定，且分離效果很好。

圖1 RP-HPLC中肽鏈與硅膠烷基組成的疏水固定相的結合情況[3]

1.2 離子交換色譜

離子交換色譜(IEXC)是通過多肽或者蛋白質在溶液中所帶電荷的正負，通過不同的陰、陽離子柱產生的靜電作用來實現對多肽的分離。陰離子交換色譜法(anion-exchange，AEC)[9, 10]和陽離子交換色譜法(cation-exchange，CEC)[9]是分離多肽混合物的重要手段。IEXC最為明顯的優勢在于它的分離條件最接近生物的生理環境，對生物分子有一定的兼容性，以便于保存多肽的生物活性。王賢純等[11]利用IEXC與RP-HPLC結合的方法，研究了固相合成出來的虎紋捕鳥蛛毒素-I (HWTX-I)和其對應的天然產物的結構的差異。劉標等[12]利用IEXC-RPHPLC脫除了胸腺肽α-1中的有機鹽，使胸腺肽的純度達到99.2%，收率為92.0%。王璐等[13]利用強陽離子交換色譜，實現了對酵母全蛋白中的胰蛋白酶的酶切產物最佳分離，并優化了分離條件。齊楠等[14]以AA、AMPS作為功能單體，采用Bis為交聯劑，1，4-丁二醇、正十二醇為致孔劑，DMSO，AIBN為引發劑制備了強陽離子交換整體柱，并使用該柱成功分離了5種多肽。

1.3 體積排擠色譜

體積排擠色譜(SEC)又稱凝膠排擠色譜或者尺寸排擠色譜，主要應用于多肽的相對分子質量的分級分析以及相對分子質量分布的測試。目前，一種較適宜分離多肽的體積排阻色譜柱(Superdex Peptide，Pharmacia，Piscataway，NJ)問世，其分離范圍為100～7000 Da，很大程度上提高了該種方法在純化合成肽時的分離效率。體積排阻色譜是最早應用于分離純化混合肽的方法[15, 16]。相比于其他測定相對分子質量的方法如質譜法、凝膠電泳法、超濾法等，SEC分離方法簡單，速度快捷，且產物不容易變性。汪冰等[17]以β-淀粉酶和胰島素作為相對分子質量標記物，采用SEC對阿膠中蛋白質和多肽的相對分子質量進行了分析，研究發現其相對分子質量為6×10∧3～2×10∧5。姜寧等[18]利用SEC分離并純化了一種新的馬鹿茸多肽CAP。張政[31]等將凝膠色譜與離子色譜兩種模式結合，實現了對蛋白質的全二維分析,其中酵母蛋白質的第一維餾分切割17次時的色譜圖如圖2所示。

圖2 第一維餾分切割17次時酵母蛋白質的色譜圖[31]

1.4 疏水作用色譜

疏水作用色譜(HIC)的作用原理與RP-HPLC的相似，只是固相柱的疏水性相對較弱，一般用于蛋白質的分離和純化。郭立安等[19]利用高效疏水色譜，直接從大腸桿菌表達的基因重組人干擾素-α包涵體的裂解液中純化了rhIFN-α，并大大簡化了操作步驟。

1.5 親和色譜

親和色譜(AC)也稱親和層析，是一種利用固定相與物質的特異性結合來實現分離和純化目的的方法。楊杪等[20]利用二磷酸腺苷瓊脂糖親和層析的方法成功從小鼠肝臟的腫瘤組織中分離和純化熱休克蛋白(HSP)70多肽復合物。

1.6 多維高效液相色譜

多維高效液相色譜(MD-HPLC)是指將兩種或兩種以上的不同的分離模式的色譜柱通過特殊的方式組合起來，這樣就可以發揮不同色譜技術各自所特有的分離技術，從而能夠將具有復雜成分的混合物中的幾種組分進行快速的分離。楊麗佳，武梅等[21]采用多維高效液相色譜技術從厚殼貽貝血清的抗菌肽中分離純化出了五種抑菌活性比較明顯的組分，在厚殼貽貝血細胞的抗菌肽中分離純化出了六種抑菌活性比較明顯的組分。劉少華，楊林等[22]采用多維高效液相色譜從舟山黃?？侄局蟹蛛x出了7個組分，其分離結果如圖2所示。隨后與動物實驗結合，驗證了這七種組分是具有強殺蟲活性以及低哺乳動物活性的殺蟲，質譜結果表明，這7個多肽分子量在2～5kDa之間,經動物毒性檢測,收集7個活性組分。

1.7 液相色譜與質譜聯用

質譜分析(MS)已經廣泛應用于多肽分離純化后的分析。而且MS具有高靈敏性和快速性等特點，與液相色譜聯用之后稱液質聯用(LC-MS)，特別適合于多肽及蛋白質的分析。李萌等[23]運用LC-ESI-MS技術對重組抗腫瘤抗病毒蛋白樂復能進行了分析，測得該蛋白質的相對分子質量為19.31163kD。李燦等[24]利用高效液相色譜-質譜法，采用正離子模式進行對于僵蠶蛋白酶解多肽進行了氨基酸種類的分析，其分離色譜柱為Hola C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7μm)，其流動相為0.05%甲酸水溶液和0.05%甲酸-乙腈溶液，其樣品的多肽類色譜分布峰如圖3所示，其樣品的總質譜圖如圖4所示。王傳現等[25]利用高效液相色譜與質譜的聯用檢測了10種化妝品中的糖皮質激素類違禁藥物。

圖3 樣品總離子流色譜圖[24]

圖4 樣品的總質譜圖[24]

2 其他新型色譜在多肽分析中的應用

2.1 超臨界流體色譜

超臨界流體色譜(SFC)是指以接近或超過臨界的溫度和壓力的高壓流體為流動相,以固體吸附劑或鍵合到載體上的高聚物為固定相的色譜技術。超臨界流體(Supercriticalfluid，SCF)的高擴散性和低粘性使得混合物中不同組分的分離速度加快。SFC拆分藥物一般來說可分為直接分離法和間接分離法，而對于氨基酸、多肽類等物質的分離一般是采用直接分離法中的手性固定相(CSPs)[26]。Antony J. Berry等[27]采用一氯二氟甲烷-10% 甲醇 (0.5% TFA) (110°C, 30MPa)作為流動相，通過超臨界流體色譜從不純的馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸水合物中分離出來一種血管緊張素轉換酶的底物(含3個氨基酸的小肽)。

2.2 徑向色譜

徑向色譜(Radial-flow chromatography)是對復雜的樣品進行快速分離尤其實在生物復雜樣品的分離等方面的一種新型色譜技術。與傳統色譜技術相比，徑向色譜技術具有速度快，容易放大生產，成本低、使用壽命長[28]。Kikumoto等[29]采用徑向色譜技術分離出了白細胞介素-1。

2.3 毛細管電色譜

毛細管電色譜(CEC)是指以電滲流或壓力流與電滲流相結合為流動相的一種新型的微柱分離技術。CEC技術具有快速分離，高選擇性等特點。Samuel Karenga和Ziad El Rassii[30]利用CEC技術分析了溶菌酶中的胰蛋白酶的水解肽段，其中主要的肽段都在較短的時間內檢出。

3 總結及展望

隨著生命科學的發展，多肽在生化領域的地位也愈發重要，而對于多肽的分離純化的要求也是愈發的高。為了得到所需要的目標多肽，可以利用上述幾種方法對于目標產物進行分離分析和提純。每種測試方法的側重點不同，單一的分離分析方法在一定程度上并不能滿足對于多肽分離、分析、純化的實驗要求，而多種液相色譜法的聯合使用，既可以高效地對多肽進行分離分析，又提高了實驗結果的準確性。比如，將幾種色譜方法結合起來使用，建立一個多維的色譜研究方法；又或者將毛細管電泳以及高效液相色譜兩者的優勢結合起來的分析方法，以及高效液相色譜與質譜的聯用技術。這些技術的聯用將會在多肽的分離純化分析中發揮著極其顯著且重要的作用。

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