食品免疫快速檢測新方法及增敏技術研究

謝春花，柳雙，馬寧寧，游瀅瀅，張爽，宋洋

（天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

食品安全問題日益復雜，建立靈敏、高效、可現場檢測的免疫方法是食品快速檢測的發展趨勢。近些年來，免疫傳感器及其增敏技術、熒光免疫層析技術、可視化凝膠柱免疫檢測技術迅速發展，并應用于食品檢測。制備可現場檢測的可視化便攜性小型儀器設備、研發新型標記技術與標記材料、探究新型分析形式是未來食品安全快速檢測的重要發展方向。本文綜述了新型免疫檢測方法以及結合納米顆粒[1]、親和素體系[2]、納米磁性材料[3]、量子點[4]等標記技術達到的增敏效應，采用仿生抗體等新型的標記技術為食品安全快速檢測技術的研究提供文獻支持。

1 免疫傳感器

免疫傳感器是根據抗原（抗體）對抗體（抗原）的特異性識別而制成的[5]。它使檢測的靈敏度得到了提高，而且使用的檢測設備小且方便，測量過程自動化，同時使分析過程簡單化，從而減少了分析時間。目前已經開始用免疫傳感器來檢測食品中的毒素和細菌、毒品和藥物的濫用、殘留的農藥量以及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）光纖等[6]。2013 年Yang Song等[7]利用偶聯完全抗原的自主裝芯片對水果及果汁中的亞胺硫磷進行了痕量檢測，其檢測限達到ng/L級，檢測時間縮短為30 min，其活化的芯片可對30個樣品進行反復測定。其研究結果與同源抗體建立的直接競爭酶聯免疫吸附（direc-competition enzyme linked immunosorbent assay，CD-ELISA）方法進行比對，在檢測時間、靈敏度、準確度方面均有提高，為表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）在食品中的快速現場檢測提供了一定的技術支撐。2014年Yang Lu等[8]研發了一種基于抑制形式的敏感和穩定的SPR免疫傳感器，用于檢測奶制品和寵物食品中的三聚氰胺（melamine，MEL）。所提出的MEL方法的靈敏度和檢測限（limit of detection，LOD）分別為 2.32×10-2μg/mL和1.4×10-3μg/mL，該測定法驗證了全奶油牛奶，脫脂奶粉，嬰兒配方奶粉，狗食和貓食中的MEL的檢測，每種樣品的檢測靈敏度分別為 2.57×10-2、2.32×10-2、2.51×10-2、2.66×10-2、2.68×10-2μg/kg，遠低于 MEL 的最大殘留量（maximum residue，MRL）。該方法由于可重復使用性，高靈敏度，短檢測時間和簡單的樣品制備過程等諸多優點，可用于痕量殘留檢測。

但無論是SPR傳感器還是電化學傳感，都是基于物理信號輸出的分析技術，不能檢測到極小的信號的變化，并且容易受到非特異性吸附的信號干擾[9]，這就阻礙了其在超靈敏檢測中的應用。為了提高檢測的靈敏度和準確性，可以采用傳感器結合增敏技術的方法，如將免疫傳感器與納米顆粒結合，2013年Xia Sun等[10]采用納米金粒子（au nanoparticles，AuNPs）和聚苯胺/羧基化多壁碳納米管-殼聚糖納米復合物的新型多層膜構建高靈敏度的檢測毒死蜱的免疫傳感器，用于檢測白菜，小菜，生菜和韭菜中的毒死婢，檢出限為0.06×10-6mg/mL。2014年Liu等[11]將SPR傳感器技術與與抗原特異性抗體結合的Fe3O4磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）分析方法相結合，開發了一種新的方法，用于大豆溴氰菊酯的直接檢測。這兩種方法的結合使檢測的靈敏度提高了4個數量級，最低可測濃度為0.01 ng/mL。2015年中國科學院電子學研究所傳感技術國家重點實驗室的鄧紹立[12]及其團隊以納米金為媒介將三聚氰胺（MEL）連接到SPR傳感芯片表面，優化最佳抗體用量和再生條件，測試芯片穩定性和方法的準確性。在無污染的牛乳中添加系列質量濃度的MEL，采用競爭抑制法建立抑制標準曲線，并對實際樣品進行檢測，該方法檢測限為3.24 ng/mL，遠低于國際食品法典委員會和國家有關部門規定的殘留量，同時相比于之前的實驗結果，檢測限更低。該方法在30 min內完成樣品的前處理和檢測，適合牛乳生產現場快速定量檢測，而且芯片制備方法簡單、造價極其低廉、無毒無污染、便于推廣、再生性能好、可多次重復使用。

同時免疫傳感器還可以與親和素相結合。生物素與親和素是自然界中親和力最強的化合物，其親和力可以達到1014。2013年南開大學信息技術科學學院劉儒平等[13]基于SPR傳感器的基礎上，通過親和素固定生物素標記的二抗，一抗與二抗反應固定于傳感器CM5芯片上，從而達到了對低濃度大腸桿菌ATCC25922的快速檢測，同時該方法通過一抗和二抗的質量擴增效應和生物素-親和素的多級放大效應，提高了SPR傳感器靈敏度，檢測下限為1.5×102CFU/mL，檢測時間約為35 min。利用生物素-親和素體系與抗原抗體的偶聯達到信號放大的目的，可有效降低非特異性吸附，提高檢測的信號，從而可縮短檢測時間并使得檢測限和靈敏度得到提高。

2 熒光免疫層析

熒光免疫層析技術是基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。該技術以固定有檢測線（包被抗體或包被抗原）和質控線（抗抗體）的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，熒光標記抗體或抗原固定于連接墊，通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動[14-17]。對于帶有多個抗原決定簇的大分子抗原（蛋白、病毒、致病菌等），通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法，即待測物在流動相作用下先與熒光標記抗體結合，當到達檢測線時再與包被抗體結合形成雙抗夾心的“三明治”型。對于只具有單一抗原表位的小分子抗原（農獸藥、違禁藥物等），待測小分子抗原與熒光標記抗體結合后，由于空間位阻作用難以再與檢測線上的包被抗體結合。所以，一般用競爭免疫層析法來檢測具有單一抗原表位的小分子物質[18]。2015年張金艷等[19]利用偶聯反應物CdTe-抗克倫特羅抗體（CdTe-Anti clenbuterol Polyclonal，CdTe-Anti CLE pAb）作為熒光標記物，組裝出一種用于檢測克倫特羅的熒光免疫試紙條，最低檢測限達0.5 μg/L（目前市場上廣泛引用的膠體金試紙條的檢出限為1.0 μg/L～3.0 μg/L），為瘦肉精市場監督提供了一個新的熒光試紙條。使用量子點的優勢在于量子點的激發光譜寬、發射光譜窄、熒光強度高、穩定性強，生物兼容性好等特點，在偶聯劑的作用下，可以與抗體相連接，形成特異性的偶合物，特別是用這種偶合物作為標記物，可以顯著降低檢測方法的檢測限。同年李靜宇等[20]采用熒光膠乳微粒為標記物制備了克隆特羅熒光免疫層析試紙條。最佳制備條件：抗原包被濃度2.00 mg/mL，膜干燥時間5 d，混勻反應時間1 min，反應溫度25℃，層析時間15 min。評價結果顯示，試紙條檢測限可達0.35 μg/L。該方法在食品安全檢測應用方面的研究已有報道，且其靈敏度是膠體金法的5倍～10倍。

2017年丁喬棋等[21]以羧基化CdTe/ZnSe量子點熒光微球為標記物，通過1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（1-Ethyl-3-（3’-dimethylaminopropyl）carbodiimide/N-Hydroxysuccinimide，EDC/NHS） 活化法將氯霉素（chloramphenicol，CAP）單克隆抗體與量子點熒光微球偶聯制備熒光探針。氯霉素全抗原（chloramphenicol-succinic anhydride-albumin from bovine serum，CAP-HS-BSA） 及羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維素膜，組裝成新型氯霉素量子點熒光微球免疫層析試紙條，建立了快速、定量檢測牛奶中CAP的方法。開發的量子點熒光微球試紙條可在15 min內完成牛奶樣品中CAP的定量檢測，線性范圍為 0.10 μg/L～100.00 μg/L，檢出限為 0.1 μg/L。該試紙條在兩周內的穩定性良好。2017年張世偉等[22]于抗體親和位點保護標記方法制備抗河鲀毒素抗體偶聯熒光微球，方法簡單穩定，所有結合分離步驟均在親和柱中完成，避免了親和位點被破壞而且熒光信號更強，將檢測靈敏度提高至原來的8倍左右。研究了熒光抗體稀釋液配方，使熒光標記抗體一體式組裝在測試卡上6個月熒光衰減小于30%，從而使該技術能夠以測試卡的形式商品化應用，所建立的河鲀毒素檢測方法靈敏度為18.4 ng/mL，檢測河鲀樣本的最低檢出限為10.00 μg/kg。該方法適用于熱加工樣品的檢測，該檢測過程非常迅速，所用時間僅15 min，且不需要用大型設備，為河鲀餐前速測提供了一定技術手段。

3 凝膠柱免疫可視化檢測

現在的檢測技術已經越來越多，但快速、可視化、普遍、實用的技術更受歡迎，而凝膠柱免疫可視化檢測技術就可以達到這種要求。2012年Meng Yuan等[23]開發了一種基于凝膠的非儀器性免疫親和試驗，用于快速篩查氯霉素（CAP）。免疫親和力測試柱（immunoaffinity test column，IATC）由含有抗CAP抗體偶聯凝膠的測試層和含有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）抗體偶聯凝膠的對照層組成?；谥苯痈偁幮悦庖叻磻屠备^氧化物酶酶促反應，可以直觀地評估測試結果。顏色的變化可代表檢測結果。結果表明，牛奶中氯霉素最低檢測量為1 μg/L、奶粉中的氯霉素最低檢測量為6 μg/L、蜂蜜中的氯霉素最低檢測量為4 μg/L、魚和蝦中的氯霉素最低檢測量均為2 μg/L。該測定方法幾乎不需要樣品預處理，整個過程在10 min內即可完成?；谀z的免疫親和測試是一種簡單、快速且有前途的檢測方法，可用于食品樣品中CAP殘留物的可視化快速檢測且無需儀器設備。

2016年生威等[24]采用活化酯法制備恩諾沙星與辣根過氧化物酶（HRP）的偶聯物作為酶標抗原。整個檢測在一個標準的1 mL固相萃取柱（solid phase extraction column，SPE）中進行，柱中包含兩層：一個結合了恩諾沙星特異性抗體的凝膠檢測層和一個結合了HRP抗體的凝膠質控層。將樣品提取液與酶標抗原預混合后加入到檢測柱中，基于抗原抗體的競爭結合反應和辣根過氧化物酶的酶促反應，根據檢測柱的檢測層顏色的深淺和有無來定性半定量檢測恩諾沙星的含量。該凝膠檢測柱的檢測限為5 μg/L，整個檢測過程可以在10 min內完成，豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉和牛奶等動物源性食品中恩諾沙星檢測限為100 μg/kg。該方法具有準確、靈敏、特異性好、操作簡便快速、成本低等優勢，適合動物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查。而在2017年生威等[25]又采用類似的方法半定量檢測呋喃它酮代謝物的含量。整個檢測過程可以在10 min內完成，該凝膠檢測柱的檢測限為20 μg/L；牛肉、鯛魚、雞肉、蝦肉、豬肉、魷魚、雞肝和黃花魚等動物源性食品中呋喃它酮代謝物的檢測限為3 μg/kg。同年齊玉杰等[26]采用活化酯法制備三聚氰胺酶標抗原，將三聚氰胺抗體、過氧化物酶抗體分別與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯制備相應的抗體膠作為檢測層和質控層，方法檢測限為200 μg/L。對牛奶、奶粉、發酵乳等乳制品進行檢測，測得所檢樣品中三聚氰胺的檢測限為1 mg/kg。該檢測方法操作簡便，結果易判斷，整個檢測過程約15 min，是三聚氰胺現場快速檢測的有效手段。

4 仿生免疫檢測

免疫檢測方法多數具有穩定性不好的缺陷，而仿生抗體便可以解決這個難題。仿生免疫檢測是指分子印跡聚合物（molecular imprinting polymer，MIP）具有的可以特異性識別待測物質的位點，與待測物質特異性結合，類似于抗原抗體識別反應。利用仿生免疫方法進行分析的方法稱為仿生免疫分析。仿生抗體可以與不同的檢測方法結合，從而達到不同的效果，目前國內外已經有很多相關的研究。

4.1 仿生抗體用于酶聯免疫吸附檢測

2015年ChenShi等[27]描述了一種新的直接競爭性酶聯免疫吸附測定方法，其中親水印跡膜作為用于測定多農藥殘留物的仿生抗體。使用4-（二甲氧基硫代硫代氨基）丁酸作為模板分子，直接在96孔板的表面上合成可選擇性識別敵百蟲和乙酰甲胺磷的印跡膜。該膜具有抗體樣識別能力，快速吸附-解吸動力學和良好的穩定性。該方法適用于蘆筍和黃瓜樣品中敵百蟲和乙酰甲胺磷的測定，其中敵百蟲的回收率為72.1%～92.0%，乙酰甲胺磷為70.0%～85.0%。該測得所取韭蔥樣品中的乙酰甲胺磷水平為（2.15±0.08）mg/kg，高于日本肯定列表系統的最大殘留限量（MRLs，0.1 μg/mL）。因此，應該加大力度控制農產品中的農藥殘留。與傳統的酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和色譜方法相比，該方法的操作程序更簡單，并且不需要大量的儀器。由于MIP的高選擇性和不需要SPE等預處理程序，因此仿生酶聯免疫吸附測定法（bionic enzyme-linked immunosorbent assay，BELISA）方法的基質效應很小。此外，BELISA方法可以選擇性識別和檢測敵百蟲和乙酰甲胺磷，更重要的是，該方法可以重復使用超過10次并保持靈敏度。2017年Lu Li等[28]利用分子印跡聚合物（MIP）膜作為仿生抗體，開發了具有高度選擇性和高靈敏度的ELISA，可用于檢測孔雀石綠（MalachiteGreen oxalate，MG）。多巴胺的自聚合MIP膜附著在96孔微板的表面上，在水溶液中可對MG特殊識別。通過該方法建立的直接競爭ELISA，靈敏度達到了10.31 μg/L，其檢出限為0.30 μg/L。通過該法對水、魚樣品進行檢測，加標回收率為87.8%～94.6%，相對標準偏差小于3.6%。結果說明該方法可用于樣品的快速，準確的檢測。2018年Zhang等[29]開發了基于具有特定識別的紙上分子印跡聚合物（MIPs-paper）的BELISA。BELISA的作用原理是利用3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（3-（methacryloxy）propyltrimethoxysilane，γ -MAPS）水解作用對紙張表面進行改性，并通過共聚將其固定在γ-MAPS改性紙上以構建人工抗體。通過一系列實驗和驗證，成功獲得了MIPs，并建立了一種基于MIPspaper的BELISA法，該法可簡單有效的檢測西維因且具有成本低、準備簡單、準備時間短、重復性好、經濟實惠等優點。該法的靈敏度和檢測限分別為0.116 mg/L和0.007 mg/L，而中國國家食品安全標準（2014）宣布食品中西維因的最高殘留限量為1 mg/kg，該方法的靈敏度和檢測限遠低于國家標準?；贛IPs-paper分析方法的高選擇性，該方法成功應用于分析水稻和大白菜樣品中的西維因，并測得其添加回收率在67.2%～119%之間。該方法不僅可以為食品安全領域快速檢測提供技術支持，還可為西維因快速高效檢測提供便利工具。

2012年任蕾[30]以苯磺隆為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，采用本體聚合法在96孔酶標板上直接合成了對苯磺隆具有高選擇識別能力的分子印跡聚合物膜，苯磺隆分子印跡聚合物膜具有較高的特異性和較快的傳質速度。在相同的實驗條件下，印跡聚合物膜的飽和吸附容量最高可達到非印跡聚合物膜飽和吸附容量的1.28倍。在最適條件下，所建立仿生酶聯免疫方法的靈敏度即IC50為 15.77 μg/L，最低檢出限即 IC15為 0.01 μg/L，遠低于歐盟規定的苯磺隆的最大殘留限量0.05 mg/L。2015年李鴻英[31]采用本體聚合方法以3，5-二羥基-2-萘甲酸為假模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，在酶標板孔表面直接紫外引發合成了對桔霉素分子印跡聚合物膜，成功將分子印跡技術應用于免疫分析中，建立了一種食品中桔霉素分子印跡仿生酶聯免疫吸附法。印跡膜飽和吸附容量達到1.07 μg/well，明顯高于非印跡聚合物膜（0.213 μg/well）。此方法被成功地應用于米飯，玉米，米醋三種樣品中的桔霉素的分析檢測，測得米飯的最低檢出限為 40 μg/kg、玉米的最低檢出限為 60 μg/kg、米醋的最低檢出限為20 μg/kg，3個添加濃度下的回收率分別達到73.2%～89.9%，64.3%～86.2%和82.3%～92.8%。但該法也存在一定的局限性：如可供選擇的親水性功能單體比較單一，從而對生物抗體的選擇性和專一性造成了影響。2017年呂春暉等[32]在聚苯乙烯酶標板表面直接合成對恩諾沙星具有特異性識別吸附能力的分子印跡聚合物，將其作為仿生抗體代替生物抗體，建立直接競爭仿生酶聯免疫分析法（ELISA）進行恩諾沙星的檢測。最適條件下仿生酶聯免疫方法的最低檢出限（IC15） 為 0.80 μg/L，靈敏度（IC50）為65.93 μg/L。該方法對雞肉組織和豬尿兩種樣品的添加回收實驗中（雞肉加標量分別為 2.5、15、75 μg/kg；豬尿加標量分別為 5、30、150 μg/kg），有較高的回收率（雞肉：97.30%～103.56%；豬尿：94.48%～96.53%）。該仿生ELISA法準確度、精密度及特異性均較高，步驟簡單，與傳統ELISA方法相比省時經濟，可以應用于實際樣品中恩諾沙星殘留的快速檢測。

4.2 仿生抗體與SPR結合

2013年Gui-Hong Yao等[33]將表面等離子體共振（SPR）光譜整合并將其與表面分子印跡識別系統結合，同時利用磁性分子印跡聚合物即納米粒子放大SPR的響應值，從而提高了檢測的靈敏度。磁性分子印跡聚合物是在模板毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）的基礎上弱堿性水溶液中Fe3O4納米粒子（Fe3O4nanoparticles，Fe3O4NPs）表面上的多巴胺自聚合而設計的。通過傅立葉變換紅外光譜，紫外可見吸收光譜和透射電子顯微鏡表征印跡的Fe3O4@聚多巴胺（polydopamine，PDA）納米粒子。在 0.001 μmol/L～10 μmol/L 的范圍內，生物傳感器的SPR角度變化與毒死蜱濃度呈良好的線性關系，檢測限為0.76 nmol/L。因此，通過使用印跡Fe3O4@PDA納米粒子作為放大器可以顯著提高靈敏度，同時，印跡Fe3O4@PDA納米粒子對毒死蜱的識別能力優于其他殺蟲劑。設計的生物傳感器具有卓越的靈敏度和選擇性以及高度的穩定性，并對蘋果樣品進行了測定，獲得了93%～104%的回收率，說明該方法在實際樣品中使用具有良好的準確性和實用性。2015年Mehmet等[34]通過在金片表面制備烯丙基硫醇的自組裝單層，形成用于選擇性測定牛奶中的催產素的分子印跡表面等離子體共振傳感器，該方法新穎且靈敏的。然后，在烯丙基硫醇修飾的芯片上進行催產素（Oxytocin，OXT）印跡的聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酰胺基谷氨酸）納米膜。通過傅里葉變換紅外光譜、原子力顯微鏡、橢偏儀、掃描電子顯微鏡和接觸角測量對未改性和改性表面進行表征?；诒砻娴入x子體共振的分子印跡傳感器也成功應用于牛奶樣品中催產素的測定，檢測極限為0.003 0 ng/mL。催產素印跡表面等離子體共振傳感器良好的重復性為以后傳感器的研究提供了參考。2018年Onac等[35]利用碳納米管包裹聚合物膜開發了用于測定三聚氰胺的表面等離子體共振的方法。它可以通過分子印跡聚合物膜測定三聚氰胺，并具有操作簡單、高選擇性、高靈敏度、低成本的優點。為此，開發了用于測定奶樣中三聚氰胺的分子印跡傳感器。該研究分3個階段完成。在第一階段，三聚氰胺由新一代碳納米管膜轉移，通過添加納米材料而得到改善。在第二階段，生產印刷的生物傳感器芯片用于測定三聚氰胺。在最后階段，制備的生物傳感器芯片被用于表面等離子體共振系統中三聚氰胺的測定和動力學分析。在10 d結束時，牛奶樣品中的三聚氰胺以82.87%的效率運輸。通過在SPR傳感器芯片的表面上制備三聚氰胺印刷聚合物納米薄膜層，以高度敏感，選擇性和簡單的方式實現了三聚氰胺的測定。通過使用新一代碳納米管膜（碳納米管聚合物（carbon nanotube polymer，CNT/PIM），開發了納米增強膜，其包括高滲透性和抗污染的機械強度，并且實現膜的活性層被最小化。制備的生物傳感器具有與傳統分析技術相比有許多特點，如快速實時識別，低成本，便攜性，簡單處理和樣品制備的簡易性。

5 食品檢測增敏技術的發展前景

食品安全作為重要的公共衛生問題，受到普遍關注。食品中殘留或存在的有害物質與人類的健康息息相關，因此高效、簡單、方便、廉價、普遍性高、靈敏度高的檢測方法成為檢測食品安全的重要目標，而新型標記技術與標記材料、新型分析形式是食品檢測新的發展方向。對國內外可視化、可現場檢測、普遍性的食品安全檢測方法以及與之結合的增敏技術作出綜述，希望為我國食品質量安全的快速、高效檢測技術的提高提供理論支持。

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