廢水資源化小球藻對擬南芥生長的肥效研究

楊方浩，侯利園，苑瑞東，程曉磊，黎瀅靜

(吉林大學，長春 130012)

過去的幾十年間，我國化肥用量逐年遞增，而肥料利用率卻僅有30%～50%[1]，過剩的富營養元素隨著農田排水或地表徑流進入河流湖泊，對生態環境造成巨大威脅，使我國各大水系均面臨不同程度的富營養化。為了加強養分資源綜合管理、改善土壤質量、實現農業的可持續發展，配方肥、生物有機肥、新型肥料的開發等措施是滿足糧食從高產高效到優質高產高效，再到提質增效轉型升級的有效手段。

藻類污水生物處理技術最早是在1957年由Oswal等[2]提出，截至目前，挪威、日本已開展培養微藻進行環境保護研究[3]。我國微藻處理污水已經應用于生活污水、味精廢水、養殖場廢水、工業廢水等相當廣泛的行業中[4-7]。在眾多微藻中，小球藻在無光異養條件下將廢水中的銨態氮轉化為細胞中的蛋白質、葉綠素等含氮物質，對氮、磷的最大吸收利用率達80%左右[8-9]，很多學者已將上述微藻深度脫氮除磷與擴大微藻生物量、制備藻類油脂等技術進行了耦合[10-12]。此外，藻類又因其具有固氮特性而被作為肥料施用于糧食、果蔬、花卉和草坪等作物上，達到促進種子萌發，提高產量，改善品質和土壤質量的目的[13-16]。然而，由于在利用過程中對藍藻未經任何處理，一些產毒的水華藍藻釋放的毒素對農業生產具有潛在威脅，使其推廣應用受到一定限制，因此，截至目前國內鮮有類似研究成果報道。筆者將微藻脫氮除磷與農業微藻肥料技術進行了耦合，以生長速度快、固氮吸磷能力強，且不分泌藻毒素的單細胞淡水微藻小球藻為供試藻株，開展廢水-微藻體統中富營養元素富集效率及廢水培養小球藻對擬南芥生長的影響，旨在為揭示富營養元素在廢水-微藻-作物系統中的循環利用機理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1模擬濃縮污水的配置。根據北方污水成分特征，污水廠二級出水中氮、磷平均含量分別以50和5 mg/L計算，來配置10倍濃縮富營養化污水。結合微藻生長最適營養條件，微藻廢水培養液具體成分及含量為：Tris base 2.42 g/L，NH4Cl 1.6 g/L，MgSO4·7H2O 100 mg/L，CaCl2·2H2O 50 mg/L，K3PO4112 mg/L，Na2EDTA·2H2O 50 mg/L，ZnSO4·7H2O 22 mg/L，H3BO311.4 mg/L，MnCl2·4H2O 5 mg/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L， CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，CuSO4·5H2O 1.6 mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1 mg/L，Acetic acid 1 mL/L；調整pH至7.0，于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫待用。

1.1.2微藻的培養。蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)，購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，采用TAP(Tris-Acetate-Phosphate)固態培養基進行藻種的保存，微藻的液態培養條件為：智能人工氣候培養箱內25 ℃恒溫振蕩培養；光照強度3 000～6 000 LX；光照周期12 h∶12 h(光照∶黑暗)。小球藻生長曲線的測定：每天取微藻培養液2 mL，采用血球計數板法，顯微鏡下觀察并計數小球藻的細胞濃度。

1.2方法

1.2.1廢水中氨氮、全磷濃度的動態監測。每天從廢水微藻混合體系中抽取水樣，并過濾微藻，通過AA3連續流動分析儀對水樣中剩余氨氮和全磷含量進行測定。

1.2.2擬南芥的盆栽試驗。供試土樣為貧營養土壤，采集自吉林省松原市，其基本理化性質為：全氮含量(1.13±0.14)g/kg，有效磷含量(12.43±1.56)mg/kg，有效鉀含量(100.55±3.85)mg/kg，有機質含量(14.66±1.59)g/kg。以擬南芥為供試植物，進行微藻肥效試驗，共設置4個處理：處理①，不施加任何肥料(CK)；處理②、③為濃縮廢水培養后收集所得小球藻藻液，重懸于水溶液，含水率為95%左右，其中處理②藻液為鮮藻液，未經破碎處理，而處理③為超聲波破碎藻液；處理④為2.0 g復合肥溶于500 mL水后的營養液。在擬南芥出苗后，每5 d用上述不同處理溶液澆灌1次，每次50 mL，測定不同生長期的擬南芥植株高度，并測定成株的根系長度，每處理重復3次。

1.2.3土壤酶活性的測定。對不同生長期的擬南芥進行根系周圍土壤樣本采樣，每次處理采集6個土壤平行樣本，其中3個樣本進行含水率測定，對另外3個樣本土壤中過轉化酶和脲酶活性進行定量測定。土壤脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法[17]測定。

2 結果與分析

2.1小球藻生長曲線的繪制從圖1可見，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)在異養條件下繁殖速度較快，每6～8 h翻倍1次，在培養第4～6天達到最大生物量。在高氮、磷模擬污水條件下，該藻的生長并未受到抑制，最高生物量出現在培養第5天，此時小球藻的細胞濃度最高值約為3.3×107個/mL，隨后進入生長穩定期。前期試驗在無氮源條件下培養小球藻，結果幾乎無生物量增長(待發表數據)，這驗證了氮元素是小球藻生長的必須元素，外源氮的引入對小球藻的生長起到了促進作用。

圖1 小球藻在高濃縮模擬污水條件下的生長曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidesa in high concentrated wastewater

2.2小球藻對污水中氨氮的吸收率根據以上生長周期狀況，對整個繁殖期小球藻吸收消耗氨氮的情況進行研究，結果見圖2。從圖2可見，隨著培養時間的延長，小球藻的生物量不斷積累，污水中氨氮濃度逐漸降低，并在培養后期達到吸附飽和狀態，此時小球藻對高濃度含氮廢水中氨氮的吸收去除率達到80%左右，表明小球藻對模擬污水中的氨氮有很強的去除能力，可用于實際污水中氨氮的去除，使污水經生物凈化處理后可進行達標排放。

圖2 氨氮含量隨小球藻培養時間的變化趨勢Fig.2 The variation trend of -N content with culture time

2.3小球藻對污水中磷的吸收率生活廢水中的磷主要來源于人體排磷和生活洗滌排磷，磷作為微藻生長繁殖的營養元素，部分可直接被其吸收利用，然而，微藻對污水中磷元素的去除率遠遠低于對氮的去除效率。該試驗設置了正磷酸鹽含量為50 mg/L的模擬水樣，對小球藻在高濃度含磷廢水中的生長情況及含磷量進行動態監測，結果表明，隨著培養時間的延長，小球藻不斷增殖，模擬污水中的總磷含量呈遞減趨勢，當生物量達到最大值時，小球藻對磷的吸附趨于飽和狀態，最大去除率為62.72%。普通生活污水中磷含量約在10 mg/L，小球藻對磷有較強的吸附能力，可以用于實際污水的生物凈化處理，且處理后可達到磷達標排放的標準。

圖3 全磷含量隨小球藻培養時間的變化趨勢Fig.3 The variation trend of TP content with culture time

2.4廢水培養小球藻藻液肥對擬南芥植株生長的生物肥效對于微藻廢水資源化的后續利用，近幾年的研究工作主要集中于微藻的生物質能源的制備和生物肥料的應用2個方面[12，18-19]。該研究為了驗證小球藻藻液的生物肥效，對擬南芥整個生長期的株高和根長進行了監測，結果見圖4、5。從圖4可以看出，擬南芥生長株高曲線呈“S”型增長趨勢，在藻液肥施用20 d內，與CK相比，不同藻液處理對擬南芥的生長并無顯著的肥效；而后隨著生長期的延長，株高長勢明顯，各處理的株高從大到小依次為處理④、處理③、處理②、處理①(CK)；從圖5可見，處理③小球藻藻液肥施用后，擬南芥平均根長比處理②的擬南芥平均根長要長出12.7%，其肥效更顯著，說明破碎細胞對于營養物質的釋放相較未破碎小球藻細胞更迅速。小球藻可利用水中銨態氮將其轉化為細胞中的含氮化合物，參與代謝途徑，經高濃度富營養污水培養后，小球藻體內累積了大量的氮磷營養鹽，經破碎處理后，胞內基質得到徹底釋放，對作物營養供給快，而未破碎小球藻藻液則通過活體代謝或死亡釋放胞內養分，因此對植物供養較緩慢，且肥力較持久。

圖4 不同處理藻液對擬南芥生長株高的影響Fig.4 Effects of different treatments of algae on the plant height growth of Arabidopsis thaliana

2.5小球藻藻液肥施用后對土壤酶活性的影響從圖6可以看出，加入普通有機肥后土壤中脲酶活性的變化最大，達到200 μg左右，與CK相比，不同處理藻液肥對土壤脲酶活性均起到不同程度的激活作用；而對于土壤蔗糖酶活性，培養前5 d，各處理間蔗糖酶活性無顯著差異，隨時間的延長，肥料中的營養元素在土壤中逐漸釋放，土壤蔗糖酶活性隨之升高，且施肥處理略高于對照組酶活性，但藻液肥與有機肥處理間酶活性無顯著性差異，培養15 d后，蔗糖酶活性隨培養時間的延長呈下降趨勢，由于蔗糖酶的活性與土壤有機碳、全氮含量有一定相關性[20]，因此，在培養后期，土壤中碳氮不斷被消耗導致其含量下降，使蔗糖酶因失去底物而降低活性。

圖5 不同處理藻液對擬南芥根長的影響Fig.5 Effects of different treatments of algae on the root length of Arabidopsis thaliana

圖6 不同處理藻液對土壤酶活性的影響Fig.6 Effects of different treatments of algae on the activities of soil enzymes

3 討論與結論

在對眾多淡水微藻吸收氮、磷的能力的研究中發現，小球藻(Chlorellavulgaris)、柵藻(Scenedesmusobliquus)、衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的脫氮除磷能力相對較高[21]。該研究結果表明，小球藻對富營養污水的凈化效果較顯著，且對高濃度富營養污水氨氮的吸附去除率高于對磷鹽的富集效率，在有氧條件下，硝酸鹽、亞硝酸鹽和銨鹽可以用于小球藻代謝過程中氨基酸和蛋白質等物質的合成；磷酸鹽可以直接被藻細胞吸收，并通過多種磷酸化途徑轉化成ATP和磷脂等有機物，使得藻細胞能同化污水中過剩的營養鹽轉化為自身的生物量，從而降低污水中的氮、磷含量。

我國北方富營養化污水的污染物成分相對較簡單，主要以氮、磷營養元素及無機鹽類為主，廢水培養微藻可以進行有效資源的后續利用。該研究結果顯示，廢水資源化小球藻對作為生物藻液肥對擬南芥的生長具有一定促進作用，從廢水中吸收固定的富營養元素以肥料的形式釋放到土壤中，經過土壤微生物的作用，供植物生長利用，土壤脲酶活性的測定結果表明，藻液肥施用后土壤的氮素狀況良好，擬南芥生長情況與氮肥釋放效果有較強的一致性?；诟粻I養污水培養而得到的微藻之所以可被用作農業肥料，原因是一方面可以為農作物提供其生長所必須的氮、磷等營養元素，促使葉菜類、馬鈴薯等作物達到增產增收的效果，另一方面能夠節約化肥施用量[19，22]。

國外學者對微藻廢水資源化的后續利用研究較多，主要圍繞廢水培養微藻來制備生物質肥料。Wuang等[23]揭示了廢水培養微藻所獲取生物質可作為生物肥料促進小麥增收，且可節約土壤中25%的氮肥施用量；國內有關將微藻廢水資源化與藻液肥在農業生產上的高值化利用相結合的報道較少。因此，未來的研究應將環境問題最小化和有限資源的合理回收利用更緊密地結合，為今后發展環境友好型節肥農業提供基礎數據。

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