鞘內注射賽庚啶緩解小鼠骨癌痛

杭黎華，衛世有，徐振鍇，蔡玥嬌，李姝娜，彭生

（1.江蘇大學附屬昆山醫院麻醉科，江蘇昆山215300；2.上海交通大學醫學院附屬新華醫院耳鼻喉科，上海200092；3.上海中醫藥大學附屬第七人民醫院麻醉科，上海200137）

SET domain containing lysine methyltransferase 7／9（SET7／9）是組蛋白 H3賴氨酸4甲基轉移酶，可使NF-κB、STAT3等轉錄因子甲基化，調控基因轉錄［1－2］。離體研究證實，SET7／9可通過激活 NF-κB p65，促進炎癥基因的表達及炎性因子的產生［3］。多項研究證實，炎性因子與骨癌痛的產生存在著密切聯系［4－5］。但是，SET7／9是否參與骨癌痛的發生目前并不明確。因此，本研究擬采用行為學實驗、藥理學及蛋白質印跡等方法來探討SET7／9在小鼠骨癌痛中的作用。

1　材料與方法

1.1　動物及分組

雄性C3H／HeJ小鼠88只，體質量20～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXK2016-0001）。小鼠自由飲水、攝食，所有動物實驗符合江蘇大學實驗動物倫理委員會的要求。實驗分2部分：第1部分實驗分為假手術組和骨癌痛組，每組8只小鼠；造模后觀察骨癌痛小鼠機械痛敏閾值（paw withdrawlmechanical threshold，PWMT）及SET7／9在骨癌痛小鼠脊髓背角中的表達變化。第2部實驗分為假手術組、骨癌痛組、骨癌痛＋賽庚啶10 nmol組、骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組、骨癌痛＋SET7／9 0.2μg組、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組（鞘內注射SET7／9 30 min后鞘內注射賽庚啶）、骨癌痛＋氯苯那敏200μg組，每組8只小鼠；觀察鞘內注射賽庚啶對骨癌痛小鼠痛行為學及脊髓背角SET7／9表達的影響。

1.2　小鼠骨癌痛模型的建立

按Schwei等［6］報道的方法建立小鼠骨癌痛模型。將保存于液氮罐中的NCTC 2472纖維肉瘤細胞株（美國ATCC公司）取出，迅速37℃水浴復蘇，然后將其注入有培養基的離心管中，20℃低速離心5 min。細胞沉淀用培養基適當稀釋后，在37℃含5%CO2的培養箱中培養。收集處于對數生長期的細胞，用α-MEM培養基懸浮腫瘤細胞，調整密度至1×107／mL，置于冰上備用。腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg／kg）麻醉小鼠后，在左膝關節處做一個長0.5～1 cm的皮膚切口，顯露股骨平臺；用牙科鉆沿股骨長軸方向鉆孔進入股骨骨髓腔，抽取NCTC 2472腫瘤細胞懸液20μL（2×105個），由鉆孔向骨髓腔中緩慢注入。注射完畢后立即采用牙科汞合金封堵穿刺孔，最后縫合切口。

預實驗中通過行為學、影像學及病理學等證實，該方法制模成功率在95%左右。本研究通過觀察骨癌痛小鼠PWMT，證實納入研究的樣本均制模成功。假手術組小鼠于股骨骨髓腔注射生理鹽水20 μL。第二部分實驗于制模手術后15 d進行鞘內注射給藥。

1.3　小鼠鞘內藥物注射

SET7／9抑制劑賽庚啶及氯苯那敏購自上海Sigma-Aldrich公司；SET7／9蛋白為 Abcam公司產品。賽庚啶、氯苯那敏及 SET7／9均參照 Hylden等［7］的方法進行鞘內給藥。右手持25μL微量注射器與脊柱上方成20°角于L5～6間隙進針，以鼠尾出現突然側向運動為成功標志；緩慢注藥，注射時間為5 s，劑量為5μL，留針10 s。預實驗中，給10只小鼠鞘內注射2%利多卡因，每只5μL，小鼠均出現雙后肢癱瘓，而雙前肢運動正常，阻滯持續10～20 min后，雙下肢活動恢復正常，表明鞘內注射部位正確。

1.4　小鼠機械痛敏閾值的檢測

采用von Frey纖毛測定小鼠PWMT［8］。小鼠于測試籠中適應30 min，采用對數級數的von Frey纖毛垂直刺激小鼠左后肢足底中部，當小鼠出現快速縮足或甩足時為陽性反應，用 up-down法［9］計算50%縮足閾值。第1部分實驗檢測術前1 d及術后5、7、12、15 d假手術組與骨癌痛組小鼠 PWMT；第2部分實驗檢測鞘內給藥前（0 h）及鞘內給藥后1、3、6 h各組PWMT。

1.5　蛋白質印跡法檢測小鼠脊髓SET7／9的表達

鞘內注射賽庚啶組脊髓背角取材時間為鞘內注射后6 h。第一部分實驗假手術組、骨癌痛組及第二部分實驗骨癌痛組、骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組小鼠深麻醉后斷頸處死（n＝4），冰上取小鼠左側脊髓背角L4～6節段。溶解于裂解液中，4℃，15 000×g離心15 min，取上清液。SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，PVDF轉膜45 min，5%脫脂奶粉溶液與室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，每次10 min；小鼠抗SET7／9（1∶1 000，Abcam公司）、β-肌動蛋白（1∶5 000，Sigma公司）4℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗（1∶500，碧云天生物技術公司）室溫孵育1 h；滴加化學發光液反應 1 min，吸干膜上的水分，暗室曝光，圖片掃描。Image J軟件對圖片進行灰度分析。

1.6　統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。行為學數據采用重復測量的方差分析，蛋白質印跡實驗數據采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　骨癌痛小鼠痛行為學改變

兩組小鼠在15 d的觀察期限內健康狀況良好，兩組小鼠術前1 d的PWMT差異無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組比較，骨癌痛組手術后7，12，15 d PWMT明顯降低（P＜0.05或 0.01）；與術前1 d相比，骨癌痛組術后7，12，15 d的PWMT逐漸降低（P＜0.05或0.01）。見表1。

表1　兩組小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

表1　兩組小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與術前1 d比較

手術后5 d　7 d　12 d　15 d假手術組　1.93±0.51　1.83±0.49　1.90±0.52　1.87±0.49　1.8組別　術前1 d 7±0.48骨癌痛組　1.87±0.48　1.85±0.47　1.38±0.46a　0.83±0.28b　0.51±0.21b t值0.417　0.379　0.032　0.007　0.003 0.697　0.821　5.607　9.773　12.851 P值

2.2　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表達

蛋白質印跡結果顯示，術前1 d假手術組和骨癌痛組小鼠脊髓背角SET7／9的表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與術后15 d假手術組或自身術前1 d相比，術后15 d骨癌痛組小鼠脊髓背角SET7／9的表達水平顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

圖1　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9表達變化

2.3　鞘內注射賽庚啶對造模后15 d小鼠痛行為學及脊髓背角SET7／9表達的影響

由表2可見，鞘內注射前（0 h）骨癌痛各組的PWMT均明顯低于假手術組（P＜0.05）；鞘內注射賽庚啶10、20 nmol呈劑量依賴性地增加造模手術后15 d骨癌痛小鼠的PWMT，在鞘內注射賽庚啶3 h后PWMT值達最高。與鞘內注射前0 h相比，骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg組、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組及骨癌痛＋氯苯那敏200μg組在鞘內給藥后1，3，6 h的PWMT均無明顯變化（均 P＞0.05）。

與骨癌痛組相比，骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組小鼠在鞘內給藥6 h后脊髓背角SET7／9表達明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

表2　鞘內注射賽庚啶對造模手術后15 d骨癌痛小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

表2　鞘內注射賽庚啶對造模手術后15 d骨癌痛小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，與同時間點假手術組比較；b：P＜0.05，與同時間點骨癌痛組比較；c：P＜0.05，與自身鞘內注射前0 h比較

組別　鞘內注射前0 h 1 h　3 h　6 h　F值　P值鞘內注射后假手術組　1.87±0.48　1.81±0.44　1.82±0.51　1.85±0.53　2.891　0.901骨癌痛組　0.50±0.18a　0.54±0.16a　0.52±0.17a　0.50±0.15a　3.142　0.974骨癌痛 ＋賽庚啶10 nmol組　0.53±0.19a　0.55±0.18a　0.96±0.24a，b，c　0.54±0.17a　3.443　0.043骨癌痛 ＋賽庚啶20 nmol組　0.51±0.17a　0.89±0.23a，b，c 1.53±0.41b，c　0.55±0.16a　4.761　0.001骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg組　0.52±0.17a　0.51±0.16a　0.53±0.17a　0.52±0.15a　2.761　0.837骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組　0.51±0.18a　0.54±0.18a　0.58±0.18a　0.52±0.16a　3.004　0.887骨癌痛 ＋氯苯那敏200μg組　0.52±0.18a　0.52±0.14a　0.53±0.14a　0.52±0.14a　2.998　0.864 F值3.681　4.207　4.539　3.740 P值0.004　0.001　0.000　0.003

圖2　鞘內注射賽庚啶對骨癌痛小鼠脊髓SET7／9表達的影響

3　討論

表觀遺傳學是指基于非基因序列改變所致基因表達水平的變化，即通過組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼 RNA調控等方式對基因的表達進行調控［10］。組蛋白修飾包括甲基化、乙?；?、磷酸化等。研究表明，表觀遺傳學參與慢性疼痛的調控過程［11］。SET7／9是催化染色質組蛋白H3K4單甲基化的關鍵酶。Laumet等［12］研究發現，在神經病理性疼痛模型中，組蛋白甲基轉移酶G9a在背根神經節中表達明顯增加，鞘內注射G9a抑制劑UNC0638可明顯減輕小鼠的痛覺過敏。本研究結果顯示，骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表達顯著增加，鞘內注射SET7／9抑制劑賽庚啶可明顯減輕小鼠骨癌痛且顯著降低脊髓背角SET7／9的表達水平，提示SET7／9可能參與小鼠骨癌痛的發展過程。

本實驗中發現，鞘內注射賽庚啶20 nmol可明顯緩解小鼠骨癌痛，鞘內預先注射SET7／9 0.2μg對骨癌痛小鼠痛行為學沒有影響，但卻可抵消20 nmol賽庚啶緩解骨癌痛的作用，提示SET7／9在骨癌痛中起重要作用。預實驗中，我們發現鞘內注射賽庚啶60 nmol對自主小鼠的痛行為學沒有明顯影響，故本實驗中選擇賽庚啶10、20 nmol鞘內注射，應可排除賽庚啶本身的藥理作用對小鼠痛行為學的干擾，使實驗結果更為可靠。這一觀察結果與Suh等［13］的研究相似，該研究證實鞘內注射賽庚啶0.31～62 nmol對自主小鼠痛行為學沒有影響。鞘內注射是研究藥物作用于脊髓的好方法［7］，但鞘內注射賽庚啶不可避免地也可作用于背根神經節。因此，本研究結果顯示賽庚啶可減輕骨癌痛，也可能包含背根神經節SET7／9參與骨癌痛的外周機制。賽庚啶除了對SET7／9有抑制作用外，還有潛在的拮抗H1受體的作用。研究發現，鞘內注射足量拮抗H1受體作用的氯苯那敏 200μg［14］，對骨癌痛小鼠痛行為學沒有明顯影響，提示賽庚啶減輕骨癌痛主要是通過抑制SET7／9。綜上所述，脊髓SET7／9可能參與小鼠骨癌痛的發展過程。

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