hsa-miR-150-5p抑制序列慢病毒載體的構建、轉染和表達

葉文廣,王景杰,張明鑫,周蘇娜

(1第四軍醫大學唐都醫院消化內科,西安　710038;2第四軍醫大學唐都醫院放療科;*通訊作者,E-mail:annyzhou0913@163.com)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的發病率正在世界范圍內明顯上升,IBD已成為一種全球性疾病,主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)[1]。目前,IBD發病率在我國乃至亞洲地區呈增高趨勢,主要治療方法是抗炎和調節免疫反應。hsa-miR-150(內源性非編碼小分子RNA)已被證明與免疫系統的發生相關,且它在IBD患者的組織及全血標本中的表達量均顯著上調[2,3]。HT29細胞能表達正常人腸細胞的形態和某些生理特性,常被作為研究小腸藥物、營養物質吸收和代謝的體外模型。因此,本研究旨在通過構建抑制hsa-miR-150-5p表達的慢病毒載體并轉染HT29細胞,篩選穩定轉染的細胞株,為將來研究hsa-miR-150-5p對IBD腸上皮免疫屏障功能的調控研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　細胞系

人結腸腺癌細胞株HT29、人胚腎上皮細胞株293T購于中國科學院上海細胞庫。

1.2　主要試劑和載體

DMEM、胎牛血清、胰酶Trypsin-EDTA Solution和鏈霉素(10 000 μg/ml)/青霉素(10 000 U/ml)購自美國GIBCO公司;大腸桿菌菌株DH5α為唐都醫院中心實驗室保存;質粒抽提試劑盒購自日本Takara公司;BamHⅠ、EcoRⅠ內切酶、T4 DNA連接酶、Marker購自加拿大Fermentas公司;Lipofectamine 2000、Trizol購自美國Invitrogen公司;LB培養基購自美國ATCC公司。Eni.S(Enhanced Infection Solution),包裝質粒pHelper1.0和pHelper 2.0質粒,及含有綠色熒光蛋白(GFP)和嘌呤霉素Puro(puromycin)抗性的GV280載體質粒,均購自上海吉凱基因有限公司。

1.3　細胞分組

根據轉染情況,分為HT29組(空白HT29細胞)、HT29-150-NC組(轉染陰性LV-NC病毒)、HT29-150-5p-down組(轉染過表達LV-hsa-miR-150-5p-down病毒)。

1.4　細胞培養

293T細胞及HT29細胞均以含100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM加入10% FBS培養,置入5% CO2、37 ℃恒溫細胞培養箱內培養。

1.5　hsa-miR-150-5p-down序列設計和重組慢病毒載體的構建及鑒定

參照miRBase數據庫人源-miR-150-5p基因序列(MIMAT000451)設計反義互補序列為5′-CACTGGTACAAGGGTTGGGAGA-3′,以此為模板進行PCR擴增。進行PCR鑒定和DNA測序。陽性克隆序列進行3次測序,測序結果通過Chromas軟件分析。

1.6　慢病毒的包裝及滴度檢測

轉染前24 h,用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞,以含10%胎牛血清的培養基調整細胞密度約5×106細胞/15 ml,新接種于10 cm細胞培養皿,待細胞密度達70%-80%時用于轉染;轉染前2 h更換為無血清培養基;將構建成功的重組質粒(20 μg)與pHelper1.0(15 μg)、pHelper2.0(10 μg)、Lipofectamine2000(100 μl)共轉染293T細胞。轉染48-72 h采用熒光法測定病毒滴度。

1.7　慢病毒轉染HT29細胞

將對數生長期的HT29細胞,按1×105個/孔接種至12孔板中,于37 ℃、5% CO2培養24 h,細胞長至密度約為20%時侵染病毒。將侵染HT29細胞的慢病毒原液用含10% FBS的DMEM培養液按梯度1 ∶10稀釋3個梯度(1 ∶10,1 ∶100,1 ∶1 000)。吸去12孔板中的原培養液,加入上述稀釋的病毒液,感染時加入Eni.S+polybrene以提高轉染率,同時設立空白對照組。轉染12 h更換成正常培養基,然后繼續培養72 h,倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達并拍照。對成功感染病毒的細胞根據藥物篩選實驗以嘌呤霉素篩選穩定細胞株。

1.8　實時qPCR檢測HT29細胞miR-150-5p的表達水平

嚴格按照產品說明書進行實時qPCR檢測轉染后的HT29組、HT29-N組和HT29-150-5pdown組細胞中miR-150-5p的表達水平。細胞中加入1 ml Trizol,按說明提取細胞總RNA并測定其純度和濃度。按照PrimeScript RT試劑盒的操作說明,以RNA為模板通過逆轉錄合成cDNA。在SYBR酶的作用下進行PCR反應。實時qPCR循環95 ℃變性3 min,95 ℃ 10 s、62 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,循環40次。

1.9　統計學分析

2　結果

2.1　重組LV-hsa-miR-150-down質粒構建情況

DNA測序結果證實重組質粒LV-hsa-miR-150-5p-down中的目的片段序列與預期的序列一致(見圖1,2),說明目的片段已成功克隆入慢病毒表達載體中。

2.2　重組慢病毒的的測定

將構建成功的質粒載體與pHelper1.0載體、pHelper2.0載體、Lipofectamine 2000共轉染293T細胞,轉染72 h通過倒置熒光顯微鏡觀察293T細胞可以看見大量綠色熒光蛋白的表達。用病毒原液按1 ∶10稀釋2個梯度(1 ∶10,1 ∶100)感染293T細胞,轉染72 h觀察GFP蛋白的表達,實驗組病毒滴度為5×108TU/ml,陰性對照組病毒滴度為8×108TU/ml(見圖3)。

斜體字母為目的片段序列圖1　LV-hsa-miR-150-down測序結果Figure 1　The sequencing of LV-hsa-miR-150-down

2.3　HT29細胞轉染結果

HT29-150組感染LV-hsa-miR-150-5p-down病毒,HT29-NC組感染陰性對照慢病毒LV-NC,感染72 h后進行熒光拍照。各組細胞熒光拍照結果可見病毒感染成功(見圖4)。

2.4　PCR驗證HT29細胞中轉染LV-hsa-miR-150-5p-down病毒效率的結果

以U6為內參,HT29組為基準,校正計算各組2-ΔΔCt值。HT29組為1.05±0.05,HT29-NC組為1.04±0.03,HT29-150-5p-down組為0.45±0.04。上述結果顯示HT29-150-5p-down組細胞與HT29組、HT29-NC組細胞相比,miR-150-5p的含量明顯降低(P<0.05,見圖5)。

重組慢病毒表達載體中已插入目的序列圖2　LV-hsa-miR-150-down測序波峰圖Figure 2 DNA sequencing of LV-hsa-miR-150-down

圖3　轉染后熒光蛋白表達情況 (×100)Figure 3　Expression of green fluorescent protein after transfection (×100)

圖4　轉染后熒光蛋白表達情況 (×100)Figure 4　Expression of green fluorescent protein after transfection (×100)

與其他兩組相比,*P<0.05圖5　實時qPCR檢測miR-150-5p表達結果Figure 5　The qRT-PCR expression of miR-150-5p

3　討論

IBD的病因及發病機制目前尚未完全清楚,通常認為由環境、遺傳、微生物感染及免疫等多種因素共同作用導致包括T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞的免疫細胞活化引發的腸上皮免疫屏障異常[4]。miRNA在調控IBD腸上皮免疫屏障功能方面的作用是當前新的研究方向[5,6]。研究顯示活動期及非活動期的IBD患者,甚至不同類型的IBD都存在著微小RNA(MicroRNA,miRNA)表達差異[7-11]。目前,關于miRNA在IBD中的研究多著重于其對腸道上皮細胞的增殖、凋亡等的影響。研究證實miRNA作為調節器可通過調控細胞因子表達參與免疫反應來應對不同病原或刺激,根據其在炎癥因子表達調節中的作用,miRNA可分為前炎癥miRNA和負反饋調節因子兩種類型[12,13]。miRNA通過與靶mRNA特異結合在轉錄后水平上對基因表達進行調控,研究發現部分miRNA與免疫細胞的存活或遷移及炎癥因子的表達相關[12-14]。因此,尋找通過調控細胞因子表達參與調節腸上皮免疫屏障功能的miRNAs在IBD的研究中意義重大。miR-150已被證明與免疫系統的發生相關[14],但目前miR-150在IBD中的致病機制研究尚局限于其對結腸上皮細胞凋亡的影響[2],而miR-150作為一個免疫相關的miRNA,是否在IBD中參與調控腸上皮免疫屏障功能及可能的分子調控機制尚缺乏報道。在后續的實驗中需要構建不同miR-150表達水平的腸上皮細胞模型,來進一步研究其在IBD中腸上皮免疫屏障調控相關的功能及機制。

常用的慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒1型基礎上修飾改造而得到的一種多用途、安全的轉基因載體[15]。為進一步闡明mir-150在調控IBD腸上皮免疫屏障功能方面的可能分子機制,本研究選擇應用重組慢病毒載體技術構建了能夠穩定而持久低表達mir-150的重組質粒,經PCR擴增測序,顯示其基因序列與miR-150反義互補序列匹配,說明miR-150-down序列正確地插入到了載體中;重組低表達慢病毒轉染HT29細胞,通過熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達情況,顯示重組的低表達慢病毒質粒能夠高效地感染目的細胞;實時qPCR檢測結果顯示轉染后的HT29細胞中miR-150的表達顯著降低。這為進一步研究miR-150調控IBD腸上皮免疫屏障的功能及作用機制奠定了基礎。

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