rh-aFGF卡波姆940凝膠對1型糖尿病大鼠皮膚創傷的修復作用

楊選鑫，惠　琦，曹高忠，劉建國，杜曉霄，李校堃,4，王曉杰

(1. 溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州　325035；2. 溫州醫科大學附屬第一人民醫院藥劑科，浙江 溫州　325000；3. 第二軍醫大學藥學院，上?！?00433；4. 溫州大學生命科學研究院，浙江 溫州　325035)

糖尿病足部潰瘍(diabetic foot ulcer，DFC)是糖尿病的慢性并發癥之一，是導致截肢的重要原因，不僅給患者帶來巨大的精神壓力、嚴重地影響生活質量，同時也給患者造成了繁重的經濟負擔[1-2]。隨著現代生活水平的提高，糖尿病患者逐年增多，因此，迫切需要開發合適的治療藥物加速糖尿潰瘍創面修復速度、提高愈合質量。

酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)具有營養和保護神經元、促進損傷修復等功能，可加速損傷愈合[3-6]。課題組所在團隊前期開發的aFGF一類新藥于2006年經FDA批準上市，商品名“艾夫吉夫”，在深Ⅱ度灼傷等急性創面的治療中顯示出明顯促愈合、提高修復質量的功效[7]。然而，aFGF應用于糖尿病等慢性潰瘍創面，效果不理想。據報道，強生公司開展了一項應用aFGF裸質粒治療下肢缺血性潰瘍的Ⅲ期臨床試驗，來自30個國家171個醫院的525個重型肢端缺血潰瘍患者參與的臨床試驗，以沒有統計學差異而告終[8]。aFGF 裸質粒Ⅲ期臨床失敗的主要原因與糖尿病等慢性潰瘍創面微環境改變，造成缺血區aFGF 基因轉錄表達能力下降，aFGF很快被細胞外環境蛋白酶降解有關。在糖尿病等慢性潰瘍創面，高糖或者壓力等外界刺激誘導產生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)激活炎癥細胞，產生過量的炎性因子，導致炎癥反應延長，炎性滲出物累積破壞創面微環境，造成細胞損傷[9]。然而，糖尿病足經藥物治療后，附近微環境改善有助于減少減輕炎癥刺激, 可提高干細胞移植后血管新生[10]。成纖維細胞、血管內皮細胞過度凋亡阻礙了肉芽組織生成，影響表皮細胞的移行及上皮化[11]。糖尿病等慢性潰瘍創面，還存在基質金屬蛋白酶過量表達，降解多種細胞外基質成分，同時糖基化終末產物的堆積使細胞外基質、膠原糖基化，阻止創面膠原的正常合成，破壞組織修復細胞的遷移環境[8]。糖尿病慢性潰瘍創面上述微環境改變直接影響損傷愈合進程，造成損傷創面的遷延不愈。

水凝膠類工程材料具有誘導組織再生，調節細胞生長、分化，且無排斥反應。生長因子和合適的載體材料組合可以防止蛋白酶水解，有效保護和緩慢釋放生長因子[12]，有望成為治療慢性潰瘍和彌漫性皮膚創傷的新方法?？ú肥潜┧徭I合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，是一類重要的藥物遞送材料[13-14]。本研究前期以卡波姆940為載體，制備加載rh-aFGF的卡波姆940凝膠，本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導制備SD大鼠糖尿病模型，研究rh-aFGF卡波姆940凝膠對糖尿病SD大鼠全層皮膚切除和燙傷兩種模型的修復作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物♂ SD大鼠，體質量180～220 g，合格證號：20070000301262，購自上海Sippr-BK實驗動物有限公司。

1.1.2試劑rh-aFGF卡波姆940凝膠由浙江省生物技術制藥工程重點實驗室提供；STZ購自Sigma公司。

1.1.3儀器手持血糖儀及試紙購自強生公司，YLS-5Q型燙傷儀購自濟南益廷科技發展有限公司，石蠟包埋機(EG1150H)和石蠟切片機(RM2235)購自Leica公司(德國)，ECLPSE 80i正置顯微鏡購自Nikon公司。

1.1　方法

1.2.11型糖尿病SD大鼠模型和皮膚創傷模型制備及分組所有大鼠實驗均在第二軍醫大學實驗動物中心(上海市)SPF級動物房完成。用0.1 mol·L-1檸檬酸(pH=4.5)緩沖液配制濃度為70 g·L-1的STZ溶液，按體質量1.0 mL·kg-1的劑量對SD大鼠進行尾靜脈注射，每天1次，連續2 d，每次配制的STZ注射液在30 min內注射完畢。自第1次注射72 h后檢查血糖，血糖≥11.1 mmol·L-1為合格模型。符合血糖條件的大鼠隨機編號，用戊巴比妥鈉按照體質量45 mg·kg-1進行腹腔注射麻醉，背部用脫毛劑脫毛。全層皮膚切除模型在背部一側做1個直徑1.8 cm圓形標記，用碘伏消毒皮膚后沿標記線將全層皮膚切除，創面按壓止血；皮膚燙傷模型用YLS5Q型燙傷儀在背部燙出直徑為1.8 cm的深Ⅱ度燙傷創面，燙傷條件為：燙頭溫度85℃，壓力0.5 kg，時間為10 s。

兩種皮膚損傷模型中的所有大鼠分為對照組(Control組)、賦形劑組(Vehicle組)和rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組(Gel 90 AU組和Gel 270 AU組)，每組8只。對照組每日僅用0.2 mL生理鹽水處理，賦形劑組每日用未加載rh-aFGF卡波姆940凝膠0.2 mL處理，rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組分別以90 AU·cm-2或270 AU·cm-2的劑量進行治療。

1.2.2糖尿病SD大鼠創面治療及愈合速度研究創面形成后當天開始治療，每天給藥1次。治療前用雙氧水、生理鹽水沖洗傷口，并用碘伏消毒創面，然后給予相應藥物，并用棉簽涂抹均勻，連續治療21 d；每天觀察每只動物傷口愈合情況，在相同條件下于0、7、14、21 d拍攝創面。傷口面積用Image Pro plus 6.0軟件計算，傷口愈合速率以愈合百分比計算，計算公式如下：Pi=(Ao-Ai)·Ao-1，其中Ao為0 d傷口面積；Ai為創傷拍攝當天的面積。

1.2.3HE染色及病理學評分連續給藥21 d后，每組隨機選擇3只SD大鼠用10%的水合氯醛按體質量4.0 mL·kg-1腹膜內深度麻醉。將傷口周圍的皮膚組織切下，在預冷4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅(HE)染色，用于組織病理學評估。使用正置顯微鏡以400的倍數觀察成纖維細胞、肌成纖維細胞、毛細血管增殖和膠原纖維表達情況。使用半定量評分，無增殖(0分)，輕度增殖(1分)，顯著增殖(2分)，明顯增生(3分)。

1.2.4統計學分析通過GraphPad Prism 5.0軟件進行t檢驗和ANOVA分析進行可量化結果的統計分析。等級資料用Radit分析。

2　結果

2.1rh-aFGF卡波姆940凝膠提高糖尿病SD大鼠皮膚創面愈合速度如Fig 1A和Fig 2A所示，所有實驗動物從創面形成當天到治療結束，傷口表面干燥無滲出，無化膿潰爛現象。rh-aFGF卡波姆940凝膠對1型糖尿病大鼠全層皮膚切除和燙傷模型均有較好的治療效果，從創面形成(0 d)后開始，隨著治療時間的延長，各組傷口面積均逐漸縮小，但縮小程度以治療組最明顯。

全層皮膚切除模型：如Fig 1B所示，經21 d治療，對照組的傷口面積為(1.00±0.24)cm2，賦形劑組為(1.08±0.17)cm2，說明賦形劑組對創面愈合無影響，差異無統計學意義。rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組傷口面積縮小分別為(0.72±0.14)cm2和(0.62±0.18)cm2，與對照組比較差異明顯(P<0.01)。如Fig 1C所示，創面面積縮小百分率：對照組平均為(64.6±14.80)%，rh-aFGF卡波姆凝膠低、高劑量組分別是(81.40±5.48)%和(84.20±4.82)%，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 1　Effect of rh-aFGF-carbomer gel on healing rate of full-thickness wound model(n=8)

A:Photographs of wound; B:Area of wound; C:Wound healing rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

燙傷模型：如Fig 2B所示，空白對照組經21 d治療燙傷面積縮小為(0.86±0.19)cm2；rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組燙傷面積縮小分別為(0.63±0.16)cm2和(0.62±0.11)cm2，與對照組比較差異明顯(P<0.05,P<0.01)。如Fig 2C所示，創面面積縮小百分率：對照組為(60.30±7.78)%，而rh-aFGF卡波姆940凝膠劑低、高劑量治療組分別為(72.80±6.89)%和(74.20±4.56)%，與對照組相比差異均具有統計學意義(P<0.01)。

2.2rh-aFGF卡波姆940凝膠提高創傷皮膚病理學評分如Fig 3所示，每組動物在實驗結束選取3只做皮膚HE病理切片檢查，重點觀察成纖維細胞、肌成纖維細胞細胞、毛細血管和膠原纖維增殖情況，采用半定量化評分。如Fig 3B、3D所示，rh-aFGF卡波姆940凝膠明顯促進兩種皮膚創傷模型的成纖維細胞增殖(P<0.05)。并且從Fig 3D可知，rh-aFGF卡波姆940凝膠能明顯促進燙傷模型膠原纖維生成(P<0.05)。

Fig 2　Effect of rh-aFGF-carbomer gel on healing rate of scalded skin(n=8)

A:Photographs of skin wound; B:Area of wound; C:Wound healing rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3　討論

糖尿病潰瘍創面微環境改變，導致組織生長因子及其受體表達下調，是糖尿病潰瘍難愈合的重要原因之一[11]。aFGF在創面愈合中的作用已得到廣泛認可，但是在炎癥因子介導的慢性潰瘍創面，aFGF很容易被細胞外蛋白酶降解而喪失藥理作用[15]，因此，aFGF應用在糖尿病等慢性潰瘍創面其效果受到極大影響。

本研究利用STZ誘導產生1型糖尿病，制備SD大鼠全層皮膚切除和燙傷模型，模擬糖尿病患者急性損傷和慢性損傷的修復過程，研究rh-aFGF卡波姆940凝膠對糖尿病損傷的修復作用。實驗結果顯示，rh-aFGF卡波姆940凝膠對1型糖尿病SD大鼠全層皮膚切除和燙傷創面有非常明顯的促進愈合作用，創面面積經14 d治療后明顯縮小。在全層皮膚切除模型和燙傷模型的增殖評分中，對照組四項指標評分指數總和分別為16和13，賦形劑組指數總和分別為14和16，兩者較為接近。rh-aFGF卡波姆凝膠高、低劑量組均顯示較高纖維細胞指數和新血管指數，指數總和均大于23，從病理學評分綜合顯示較好治療效果。有文獻報道，皮膚癤癰潰瘍修復療效與抗菌活性和免疫增強作用可能有關[16]。本研究中，水凝膠rh-aFGF卡波姆940凝膠療效作用可能與改善創面微環境，提高抑菌能力和降低炎癥反應有關，其療效在全層皮膚切除模型更加明顯。以卡波姆940加載rh-aFGF制備的水凝膠，對水和氣體具有雙向通透性；具有良好屏障功能，有效抵御細菌入侵，防止感染；使創面始終處于濕潤的微環境中，不僅利于傷口愈合且可浸潤暴露的末梢神經；有效吸收傷口分泌物，避免黏連；與皮膚潰瘍面有較好接觸性能；呈透明狀，有利于對傷口愈合情況的觀察。

Fig 3　Results of HE staining of rh-aFGF-carbomer gel on skin wound model(n=3)

A.HE staining in 21 days of full-thickness model(A1:Control、A2:Vehicle;A3：Gel 90AU;A4:Gel 270AU); B.Total pathological evaluation of HE staining of full-thickness model(1:Fibroblast;2:Fibrocyte;3:Capillary Vessel;4:Collagen Fibers); C:HE staining in 21 days of scalded model(C1:Control、C2:Vehicle;C3：Gel 90AU;C4:Gel 270AU); D:Total pathological evaluation of HE staining of full-thickness model(1:Fibroblast;2:Fibrocyte;3:Capillary Vessel;4:Collagen Fibers).*P<0.05vscontrol.

上述實驗結果提示，rh-aFGF卡波姆940凝膠能明顯促進糖尿病SD大鼠皮膚創傷愈合過程，有望成為一種治療糖尿病潰瘍的新制劑。

(致謝：感謝溫州醫科大學浙江省生物技術制藥工程重點實驗室和第二軍醫大學藥學院及實驗動物中心為本研究提供科研場所。感謝在實驗過程中給予幫助的老師和同學！)

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