食源性單增李斯特菌的分離鑒定及藥物敏感試驗

李紅歡， 陳 朔， 康立超， 馬 勛， 錢凌霄， 張奇文， 杜冬冬

(1.石河子大學動物科技學院， 新疆 石河子 832003 ；2.新疆農墾科學院分析測試中心， 新疆 石河子 832003)

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，以下簡稱：單增李斯特菌)，是細胞內寄生的革蘭陽性短桿菌，一種重要的食源性人獸共患病原菌，該菌在4 ℃環境中仍可生長繁殖，通過污染奶及奶制品、蔬菜、水產品、肉制品等食物導致人群感染，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一[1]。該菌致病性強、致死率高達30%[2]，能引起人和動物李斯特菌病，如人類的腦膜炎、敗血癥、肺炎、熱性胃腸炎、流產等疾病[3]，新生兒、孕婦、老年人和免疫功能低下者更易感染發病[4]， 由于感染此菌的高致死率，我國對食源性單增李斯特菌的檢測十分重視，作為國家食品污染物和有害因素風險監測必檢微生物指標之一[5]。

近年來因食品污染本菌而引起的食物中毒病例頻繁發生，使李斯特菌病作為一種重要的食源性傳染病在世界范圍內對食品安全及人類健康造成極大的危害[6]。 歐盟報道，加拿大2009 年共發生了1 645 例由單增李斯特菌引起的食物中毒病例，比2008 年增加了19.1%[7]。 李斯特菌生命力強，能在低溫環境甚至冰箱內存活，主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一，會造成二至三成的感染者死亡。 2015 年，美國出現藍鐘( Blue Bell) 冰淇淋事件， 3 人感染死亡。 我國2000 -2009 年文獻檢索出單增李斯特菌病例92 例[8]。 國內外報道從多種食品中分離到李斯特菌或食品污染李斯特菌而引起的食物中毒暴發事例[9]，為此單增李斯特菌成為新的重要的食源性疾病病原菌，已引起了食品衛生管理部門的廣泛關注，許多國家均加強了對該菌的檢測及研究工作。

李斯特菌病相對罕見，然而一旦發生，病死率很高，因而準確及時地早期診斷及合理的抗生素治療顯得尤為重要[10]。 隨著抗生素在臨床和畜牧業中的廣泛使用與濫用，單增李斯特菌面臨嚴重的抗生素選擇壓力，已有報道[11]指出，我國出現對二線藥物耐藥的菌株，給臨床用藥的選擇帶來了很大的挑戰。 為了解新疆生產建設兵團食源性單增李斯特菌分離株的耐藥性，本研究對食源性單增李斯特菌進行耐藥性的測定，為有效控制細菌耐藥、科學評價單增李斯特菌分離株致病意義提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2014 年新疆生產建設兵團8 個師，常規送檢的外賣盒飯158 份，冷凍魚糜制品121份、調理肉制品90 份，學生餐270 份，生食肉類50份，涼拌菜21 份，冷凍飲品10 份，雞2 份，奶酪3份，糕點2 份等10 類食品共計727 份，用于檢測單增李斯特菌。

1.2 標準菌株 單增李斯特菌標準菌株標號為27708；藥敏質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 培養基和試劑 李氏增菌肉湯(LB1，LB2)，TSA-YE；PALCAM 瓊脂，單增李斯特菌顯色培養基CHROM agar，腦心浸液培養基(BHI)， 購自青島高科園海博生物技術有限公司；青霉素、四環素、慶大霉素、環丙沙星等17 種抗生素藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 方法

1.4.1 單增李斯特菌的分離培養與鑒定 參照《食品衛生微生物學檢驗》GB4789/T.30 -2010[12]并結合《全國食品污染物監測計劃- 食源性致病菌》部分方法進行。

(1)增菌：無菌操作提取樣品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1 增菌液的均質袋中，在均質器上連續均質1 min ～2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均質杯中，8 000 r/min ～10 000 r/min 均質1 min ～2 min。 于30 ℃培養24 h，移取0.1 mL，轉種于10 mL LB2 增菌液內，在30 ℃培養18 h ～24 h。

(2)分離及培養：取LB2 二次增菌液劃線接種于PALCAM 或CHROM agar 瓊脂平板上，在36 ℃培養24 h ～48 h。 再將上述顯色平板上的可疑菌落接種TSA-YE 平板和兔血平板上，30 ℃生長24 h 后，觀察菌落和溶血情況。

(3)鑒定：挑取可疑菌落進行革蘭染色，顯微鏡下觀察其形態和染色特性。 挑取可疑菌落進行GP鑒定卡鑒定。 鑒定試驗用單核細胞增生性李斯特標準菌株做陽性對照。

1.4.2 藥敏試驗 藥敏試驗按WHO 推薦的K-B瓊脂紙片擴散法[13]進行，培養基為BHI 瓊脂固體培養基。 將培養至對數期的細菌取500 μL 用涂布器均勻涂抹于BHI 固體培養板上；待培養基表面菌液吸收后，無菌鑷子夾取藥敏片貼于培養基表面，藥敏片間距不少于30 mm；37 ℃條件下培養24 h 后，游標卡尺測量抑菌圈直徑并做記錄。 藥敏結果判定采用NCCLS(CLSI)《微生物藥物敏感性試驗執行標準》M100 -S20[14]。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定 分離獲得24 株可疑細菌，菌落在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。 在CHROM agar 上的小的圓形藍色菌落，周圍有白色暈圈。 在TSA-YE 平板上30 ℃生長24 h 后，可形成半透明的圓形露滴狀菌落。 兔血平板上呈現β溶血。 可疑菌落為革蘭陽性的短桿菌，單個、兩兩平行或排列成“V”字型。 經VITEK2-compact 全自動微生物鑒定儀GP 卡鑒定為單增李斯特菌，鑒定符合率為99.9%。

2.2 食品中單增李斯特菌檢出情況 727 份樣品中檢出單增李斯特菌24 株，總檢出率為3.3%。 其中，調理肉制品檢出率最高，為17.77%；其次是冷凍肉糜制品，檢出率為4.95%；外賣盒飯中檢出率為1.26%；學生餐、生食肉類、涼拌菜、冷凍飲品、雞、奶酪、糕點等樣品中未檢出該菌(表1)。

2.3 藥物敏感 24 株單增李斯特菌分離株的17種抗生素藥敏試驗顯示：對青霉素和環丙沙星耐藥率100%，對磷霉素、氨芐西林、丁胺卡那霉素、復方新斯諾明、四環素耐藥率分別為54.17%、37.5%、20.83%、20.83%、16.66%。 大部分菌株對頭孢唑林、頭孢噻吩、亞胺培南、左氧氟沙星、諾氟沙星、強力霉素、萬古霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素敏感。

表1 樣品數量及單增李斯特菌檢出率

除LM461，LM4786，LM3189，LM3195，LM5470，LM5474 等6 株菌只對青霉素和環丙沙星耐藥外，其余菌株均表現多重耐藥，多重耐藥菌株占總分離株的75.0 %。 其 中 LM2935、 LM2956、 LM3197、LM5563、LM5573、 LM3103-1、LM6072 大和LM6072小等8 株菌出現3 重耐藥，占總分離株的33.3%；LM502、LM2941、LM3251、LM4786 和LM5570 等5株菌出現4 重耐藥，占總分離株的20.8%；LM472、LM2947、LM4788、LM5567 和LM502-2 等5 株菌出現5 重以上耐藥，占總分離株的20.8%。

3 討論

單增李斯特菌作為四大食源性致病菌之一，由于其感染病死率高、危害大，日益引起人們的重視。在國外，單增李斯特菌在RTE 食品中的污染率報道較多。 Inoue[15]等的研究表明日本零售食品單增李斯特菌污染率為5.4% ～25%，牛肉、豬肉、雞肉單增李斯特菌的污染率分別為12.2%，20.6% 和37%。 Prazak[16]等研究發現卷心菜的單增李斯特菌污染率約為3%。 楊紅菊[17]等在130 份畜禽產品樣品中共檢出致病菌46 株，其中單增李斯特菌的檢出率為16.9%，且細分品種，豬肉中單增李斯特菌檢出率最高。 龔云偉等[18]對市售26 份熟肉制品的分析結果顯示，有26.9%的單增李斯特菌陽性。 古麗巴哈爾·托乎提[19]等在冷凍飲品中檢出單增李斯特菌。 劉海霞[20]等在2010 -2016 年熟肉制品和餐飲食品中共檢出單增李斯特菌85 株， 占所采樣品的1.65%，采集的熟肉制品和餐飲食品中， 污染較為嚴重的分別為醬肉類和中式涼拌， 檢出率分別為2.66%和2.67%。 沙拉麥提·吐爾遜太[21]對新疆烏魯木齊食品單增李斯特菌檢出率的18.5%。此次常規送檢的727 件食品中共檢出單增李斯特菌24 株，檢出率為3.3%，檢出率比較低。 在食品分布中以調理肉制品污染較為嚴重，陽性率達17.77%，說明單增李斯特菌在國內、外的不同地區、不同類型食品分布存在差異。 本次單增李斯特菌的污染狀況雖然不是很嚴重，但也存在單增李斯特菌引起食源性疾病的潛在危險。

表2 24 株單增李斯特菌分離株對抗生素敏感性_________________________________

通常臨床用于治療李斯特菌病的一線藥物主要是氨芐西林或青霉素，單獨使用或與慶大霉素聯合使用，而復方新諾明、萬古霉素與慶大霉素聯合紅霉素及氟喳諾酮作為二線藥物。 本研究中對分離到的24 株單增李斯特菌進行17 種抗生素的藥物敏感性試驗， 24 株單增李斯特菌對青霉素和環丙沙星耐藥；部分菌株對磷霉素、氨芐西林、丁胺卡那霉素、復方新斯諾明、四環素、諾氟沙星和強力霉素耐藥；耐藥率分別為54.17%、37.5%、20.83%、20.83%、16.66%、8.33% 和8.33%。 且出現多重耐藥菌株，其中有5 株菌出現5 重以上耐藥，占總分離株的20.8%。 這與楊洋[22]對2005 年全國467 株食源性單增李斯特菌只對四環素和環丙沙星耐藥，且沒有多重耐藥情況結果并不一致，但與趙悅[23]等對2007 -2009 年來自22 個地區9 類1 069 株食品源單增李斯特菌的耐藥性分析，主要耐受四環素、強力霉素、紅霉素、氯霉素和環丙沙星，耐藥率6.92%，并出現了多重耐藥株，以及閆韶飛[24]報道的2012 年635 株食品源單增李斯特菌主要耐受四環素、強力霉素、紅霉素、氯霉素、環丙沙星，平均耐藥率10.39%，出現多重耐藥結果有相似之處，表明不同地區單增李斯特菌的耐藥情況不同，并且隨著時間的推移，耐藥率逐漸提高，且出現多重耐藥，提示臨床用藥前景堪憂。 雖然全球范圍的單增李斯特菌臨床用藥耐藥率還較低，但耐藥譜很廣，并出現了對青霉素和慶大霉素等一線用藥的耐受。 應當加強對單增李斯特菌耐藥性的監測，規范抗生素在臨床和畜牧業的使用，以減緩耐藥基因的轉移和降低食源性耐藥菌株的出現。

4 結論

本試驗通過對727 份食品運用食品應用國標法進行細菌分離鑒定，檢出單增李斯特菌24 株，并采用紙片擴散法對其進行了藥物敏感試驗，為有效控制細菌耐藥、科學評價單增李斯特菌分離株致病意義提供科學依據。