長足大竹象信息素結合蛋白CbuqPBP1克隆和表達分析

楊 樺，蘇 婷，楊 偉*，楊春平，周學莉，李一平

（四川農業大學林學院/四川省林業生態工程省級重點實驗室，成都 611130；2.綿陽市林業局，四川綿陽 621000）

昆蟲氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）是存在于觸角感器淋巴液中的一類水溶性蛋白質，它與進入感器內的氣味分子相結合，并攜帶脂溶性化合物穿過親水的淋巴液，送到嗅覺神經末梢[1]。而昆蟲信息素結合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs）屬于氣味結合蛋白中的一種，它能特異的與信息素結合，在昆蟲尋偶、交配等行為中起著關鍵作用[2]。存在于嗅覺感器腔內的信息素結合蛋白能識別并攜帶進入感器腔的特定信息素分子到達嗅覺神經元樹突膜上的氣味受體[3-4]。自從R.G.Vogt和L.M.Riddiford[5]在多音天蠶蛾Antheraea polyphemus雄蟲觸角中發現第一個PBPs以來，經眾多學者的探索，陸續在鱗翅目Lepidoptera、蜚蠊目Blattodea、鞘翅目Coleoptera、膜翅目Hymenoptera等多個目幾十種昆蟲觸角中發現PBPs，如蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides[6]、家蠶 Bombyx mori[7]、斜紋夜蛾 Spodoptera litura[8]、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua[9]、馬德拉蜚蠊Leucophea maderea[10]、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster[11]、意大利蜜蜂 Apis mellifera[12]、古銅異麗金龜Anomala cuprea[13]和東方銅綠金龜Exomala orientalis[14]等，這些基因包括 PBP1、PBP2 和 PBP3，其編碼的氨基酸序列同源性在32%～92%之間[15]。

長足大竹象Cyrtotrachelus buqueti Guerin-Meneville，又名竹橫錐大象，屬鞘翅目Coleoptera象蟲科Curculionidea彎頸象屬Cyrtotrachelus，廣泛分布于我國的四川、重慶、廣西、廣東、貴州、上海、江西等地以及越南、緬甸、泰國等東南亞國家[16-18]。長足大竹象寄主廣泛，危害箣竹屬Bambusa、綠竹屬Dendrocalamopsis、牡竹屬Dendrocalamus等28個竹種的竹筍，其幼蟲尤其喜歡蛀食楠竹Phyllostachys pubescens、慈竹 Neosinocalamus affinis、青皮竹 Bambuusa textiles、撐蒿竹 Bambusa pervariabilis、綠竹 Bambusa oldhamii等叢生竹的竹筍，是一種幼蟲生長速度快、隱蔽性強的蛀食性竹林害蟲[19-20]。一年中有11個月生活在土壤中，在地上的1個月中，約15 d生活在竹筍內[21]。長足大竹象氣味結合蛋白相關研究目前未見報道，因此，本研究依據長足大竹象轉錄組數據設計引物，克隆長足大竹PBPs基因，并采用定量PCR方法檢測了該基因在不同蟲態和雄蟲不同組織中的表達水平，以期為進一步研究該基因的功能奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蟲源：在2016年7月中下旬和8月中旬長足大竹象成蟲出土盛期和幼蟲期，于四川省蘆山縣思延鄉銅頭村（102°91′N，30°13′E）慈竹林采集剛羽化出土未交配成蟲與幼蟲，逐頭分裝于筒形牙簽盒內（直徑5 cm，高10 cm）。帶回實驗室，對雌、雄成蟲、幼蟲（混合齡級）以及雄蟲的觸角、頭部（去觸角）、胸部、腹部、足分別收集后，立即放入液氮中快速冷凍，并置于-80℃冰箱中保存備用。

試劑：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、DNAmark DL2000，日本TaKaRa公司；Taq PCR MasterMix、大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態細胞、氨芐青霉素、50×TAE緩沖液，天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量試劑盒及其它相關試劑，寶生物工程（大連）有限公司。

儀器：ABI step one plus熒光定量PCR儀、NANODROP RNA質量檢測儀，美國ABI公司；PTC200 PCR擴增儀、GelDocXR凝膠成像系統、電泳儀，美國伯樂（Bio-Rad）生命醫學產品（美國）有限公司；DU800紫外分光光度計，BeckmanCoulter（美國）公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

取長足大竹象雄成蟲觸角10對，液氮研磨后按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書提取觸角總RNA，最后溶于50 μL去RNA降解酶水中，置于-80°C保存備用。

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明書操作流程，往 PCR 管中加入 2 μL 5×PrimeScript?Buffer、0.5 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I、0.5 μL Oligo dT Primer（50 μmol/L）、0.5 μLRandom6mers（100 μmol/L）、4.5 μL RNase Free dH2O，最后加入 2 μL total RNA。將上述混合物于PCR儀中逆轉錄合成第一鏈cDNA：37°C 保溫 15 min，85 ℃失活 5 s，4 ℃保持，反轉錄產物置于-20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增cDNA片段

根據長足大竹象轉錄組數據（GenBank登錄號：SAMN06176790）設計特異性引物（表1）。PCR反應體系為 25 μL：1 μL 反轉錄第一鏈 cDNA、2 μL 上下游引物、9.5 μL ddH2O、12.5 μL Premix Taq。PCR 反應條件：94℃預變性4 min，94℃C變性30 s，41.3℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃延伸7 min，4℃保持。精確吸取5 μL PCR產物，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，6×loading buffer染色，凝膠成像系統拍照。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 PBP基因的克隆

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書的操作步驟進行膠回收，參照pMDTM19-T Vector說明書，配制10 μL 反應體系：1 μL pMDTM19-T Vector，2 μL 膠回收產物，2 μL ddH2O，5 μL SolutionⅠ。PCR儀里16℃反應30 min。連接產物采用熱擊法轉化Escherichia.coli DH5α感受態細胞，在含有氨芐青霉素的固體培養基上培養過夜，經藍白斑篩選，挑取8個白色單菌落進行菌落PCR（反應體系及條件同上）鑒定，鑒定為陽性克隆的樣品送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.2.4 序列分析

將獲得的序列在NCBI中進行BLAST同源性檢索，利用ORF Finder查找開放閱讀框。使用SignaIP進行信號肽預測，TMHMM進行跨膜區預測，ExPASy-ProtScale進行親脂性分析，compute pI/Mw預測蛋白質的等電點及質量，并通過BLAST分析推導氨基酸序列。從NCBI查閱昆蟲PBP氨基酸序列，通過Clustalx及MEGA 5.0建立系統進化樹，采用Bootstrap值檢驗系統數的置信度，各重復1 000次。

1.2.5 長足大竹象CbuqPBP1基因的相對表達量分析

取雌、雄成蟲、幼蟲（混合齡級）以及成蟲的觸角、頭部（去觸角）、胸部、腹部、足各10 mg，分別提取總RNA，取2 μg RNA反轉錄獲得cDNA，每個蟲態和組織設3次重復。根據長足大竹象PBP基因（GenBank登錄號：KU845733）設計特異性引物，并根據長足大竹象轉錄組數據（GenBank登錄號：SAMN06176790）設計內參基因引物，每個樣品重復3次（表1）。采用SYBR Green I染料法進行實時熒光定量 PCR，20 μL 反應體系為：2×YBR?Premix Ex Taq II 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各 1 μL、cDNA模板 1 μL、ddH2O 7 μL。反應條件為：95 ℃預變性40 s，95 ℃變性 10 s，57 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 20 s，45個循環。

1.3 數據分析

長足大竹象PBP基因的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算[22]。采用SPSS 20.0軟件進行試驗數據的統計分析，用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 長足大竹象CbuqPBP1基因序列分析

根據長足大竹象轉錄組結果設計引物，提取長足大竹象成蟲觸角總RNA，用紫外分光光度計測定所提取總RNA純度，OD260/OD280為1.9，反轉錄為cDNA后，以長足大竹象觸角的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到530 bp左右的特異性條帶，基因長度與PBP/GOBP family相符。在NCBI上經BLAST分析，發現此序列與鞘翅目的金龜類昆蟲PBPs一致性較高，證明獲得的序列為長足大竹象性信息素結合蛋白基因命名為CbuqPBP1（GenBank登錄號：KU845733.1）。

CbuqPBP1進行ORF預測，結果表明，CbuqPBP1基因包含1個長為432 bp的開放閱讀框，編碼143個氨基酸殘基，其中前17個氨基酸殘基為預測的信號肽，預測蛋白分子量為15.84 kDa，等電點為4.60，含有6個保守的半胱氨酸位點，具有昆蟲PBP一級結構的典型特征，CbuqPBP1基因核苷酸序列和推導的氨基酸序列見圖1。

圖1 長足大竹象CbuqPBP1核苷酸序列及推導的氨基酸序列Figure 1 Nucleotide and putative amino acid sequences of CbuqPBP1 gene from Cyrtotrachelus buqueti

將推定的CbuqPBP1氨基酸序列在TMHMM在線預測網站上預測發現該蛋白沒有跨膜區（圖2），推測該蛋白為分泌蛋白。用J.Kyte和R.F.Doolittle[23]的方法對CbuqPBP1氨基酸序列進行親脂性分析，發現CbuqPBP1氨基酸序列中含有較多的親脂性氨基酸，以第70-80位和第120-140位的親脂性較強，推測其可能是CbuqPBP1與脂溶性氣味物質的結合位點（圖3）。

2.2 長足大竹象CbuqPBP1系統發育分析

氨基酸序列相似性分析表明，CbuqPBP1與鞘翅目和鱗翅目17種昆蟲的27個PBPs相似性為37.68%。其中，與鞘翅目和鱗翅目昆蟲相似性分別為38.47%和52.39%（圖4）。應用MEGA 5.0通過鄰接法對27個PBPs序列運算1 000次獲得系統進化樹表明，昆蟲PBPs以目聚類的趨勢明顯，主要分為鱗翅目和鞘翅目兩大分支（圖5）。目以下分支中，長足大竹象與紅銅麗金龜Anomala rufocuprea的ArufPBP2和ArufPBP3在一個亞分支上，說明PBPs聚類結果能較好的反映昆蟲間的親緣關系。

圖2 長足大竹象CbuqPBP1跨膜區預測Figure 2 Predicted transmembrane segment of CbuqPBP1 from Cyrtotrachelus buqueti

圖3 長足大竹象CbuqPBP1氨基酸親脂性分析Figure 3 Predicted hydropathy profiles for the amino acid sequences of CbuqPBP1 from Cyrtotrachelus buqueti

2.3 長足大竹象CbuqPBP1表達分析

長足大竹象不同蟲態和不同組織中的CbuqPBP1相對表達量見圖6。不同蟲態體內CbuqPBP1的表達存在差異，雄蟲體內的表達量最高，是雌蟲表達量的5倍，而幼蟲體內的表達量最低，為雄蟲表達量的1/100。

在雄蟲各組織部位中，CbuqPBP1在觸角中的表達量最高，是頭部和胸部表達量的41.2倍和114倍，而在腹部和足上幾乎不表達。

3 討論

圖4 長足大竹象與其他昆蟲的信息素結合蛋白氨基酸序列多重比對Figure 4 Alignment of the amino acid sequences of PBPs from Cyrtotrachelus buqueti and other insects

本文利用RT-PCR和TA技術，首次克隆出長足大竹象一個信息素結合蛋白基因CbuqPBP1。該基因具有昆蟲PBPs典型特征，有一個N-末端保守信號肽，具有6個保守的半胱氨酸殘基，可用Cys1-X26-Cys2-X3-Cys3-X42-Cys4-X10-Cys5-X8-Cys6表示，符合Xu Y.L.等[24]鑒別鱗翅目昆蟲PBPs的經典模式（Cys1-X25-Cys2-X3-Cys3-X36-Cys4-X8-14-Cys5-X8-Cys6）。根據 J.Kyte 和 R.F.Doolittle[23]的方法對氨基酸序列進行親脂性分析，發現CbuqPBP1有多個較強的親脂性區域，與已報道的苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus AlinOBP1[25]和桃蛀螟Conogethes punctiferalis CpunPBP1[26]的親脂性區域相似，推測該區域可能是脂溶性氣味分子的結合位點。同源性比較分析表明，CbuqPBP1與紅銅麗金龜ArufPBP2和ArufPBP3相似性較高，且聚在同一分支上，推測這3個基因來源同一個祖先基因，由于在長期進化過程中對不同類型環境化學因子刺激的適應和進化使其產生了分化，在不同物種間行使相同或某些類似的功能[27]。

圖5 長足大竹象與其他昆蟲PBPs氨基酸的系統發育樹Figure 5 Phylogenetic tree of PBPs from Cyrtotrachelus buqueti and other insects based on amino acid sequences

圖6 長足大竹象不同蟲態和雄蟲不同組織中CbuqPBP1的相對表達水平Figure 6 Relative expression levels of CbuqPBP1 in bodies at different instars and different tissues male of Cyrtotrachelus buqueti

本研究中，CbuqPBP1在長足大竹象成蟲階段的表達量最高，幼蟲期微量表達，說明該基因在成蟲求偶過程中起著非常關鍵的作用。M.Laue和R.A.Steinbrecht[28]與 R.G.Vogt和 L.M.Riddiford[5]研究認為PBPs只在雄蟲體內特異性表達，而后來的研究發現如馬德拉蜚蠊[29]、斜紋夜蛾[8]、煙草夜蛾Heliothis assulta[30]、綠盲蝽 Apolygus lucorum[31]等昆蟲的 PBPs不僅在雄蟲體內表達，在雌蟲體內也有表達。這可能是雌蟲體內的PBPs也能夠識別自身的信息素，或者至少能夠識別自身信息素復合物的某些成分[32]。本研究發現，CbuqPBP1在雄蟲腹部和足上不表達，在觸角、頭部（去觸角）和胸部上均有表達，且在觸角上的表達量最高。張升祥[33]發現BmPBP1在家蠶所有組織中均有表達，BmPBP2和BmPBP3在翅和胸足有少量表達，其中，BmPBP3在脂肪體中也有少量表達，而在觸角中均有大量表達。張帥等[34]還發現棉鈴蟲Helicoverpa armigera HarmPBP2在雌蟲下顎須內有表達，但仍以觸角的表達量最高。說明觸角是昆蟲感知外界信息和接收性信息素的主要器官。

本研究發現，CbuqPBP1基因在雄蟲觸角中有較高的表達量，結合該蛋白與長足大竹象信息素類似物的競爭結合實驗結果（另文發表），推測CbuqPBP1是一個信息素結合蛋白，在長足大竹象覓偶過程中可能扮演重要角色。而長足大竹象雌性信息素包括多種組分[20]，CbuqPBP1與長足大竹象雌性信息素不同組分的結合關系目前還不清楚，需要做進一步的研究。

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