KIBRA基因多態性影響腦功能連接的fMRI研究

張寧男楠，張璋

腎腦表達蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA）基因rs17070145單核苷酸多態性與人類記憶及阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）有關。歐美高加索健康人群的相關研究顯示，KIBRA基因多態性存在多種行為學測評及腦功能區差異，但研究存在不一致性［1-8］。因此本研究將基于功能連接密度（functional connective density，FCD）方法，分析天津地區漢族健康青年人群KIBRA基因多態性對記憶測評及腦功能連接的影響，并探討其病理生理機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 于2015年3—8月連續收集在天津醫科大學總醫院查體的天津地區健康青年人。入組標準：年齡18～35歲，漢族，性別不限，右利手，無神經及精神系統疾患，無腦創傷、藥物和乙醇依賴史或其他可能影響腦結構與功能的疾病。最終納入研究的267例受試者均具有完整的行為學、遺傳學資料和磁共振影像學數據，其中男118例，女149例，年齡18～29歲，中位年齡23（21，24）歲。本研究以書面形式告知受試者研究內容并征得同意，研究內容經天津醫科大學總醫院倫理委員會批準。

1.2 行為學測評資料 （1）中國修訂版的韋氏記憶量表，包括①長時記憶：1～100、100～1、積累；②短時記憶：圖片、再認、再生、聯想、觸覺、理解；③瞬時記憶：背數；④記憶商數。（2）威斯康星卡片分類試驗中的持續性錯誤百分比。以上量表全面評估受試者的記憶及執行功能。

1.3 遺傳學資料 KIBRA rs17070145基因型檢測：從3 000 μL全血中利用EZgeneTM血液gDNA小量提取試劑盒純化提取DNA，應用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和連接酶檢測反應（ligation detection reaction，LDR）檢測C/T等位基因（委托上海翼和應用生物技術有限公司完成）。

1.4 磁共振影像學數據 采用GE 3.0T Signa HDx磁共振掃描儀及8通道頭線圈，對所有受試者進行全腦3D高分辨率T1結構像和靜息態功能磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）掃描。全腦3D高分辨率T1WI結構像采用顱腦容積成像序列進行矢狀位掃描。掃描參數：重復時間/回波時間/反轉時間8.1/3.1/450.0 ms，視野256 mm×256 mm，矩陣256×256，翻轉角度（FA）13°，層厚1.0 mm，無間隔，層數176。靜息態fMRI采用梯度回波單次激發回波平面成像（echo planar imaging，EPI）技術。掃描參數：重復時間/回波時間2 000/30 ms，視野240 mm×240 mm，矩陣64×64，FA 90°，層厚4.0 mm，無間隔，層數40，采集180個時相。

1.5 數據處理

1.5.1 靜息態fMRI數據預處理 采用基于Matlab的SPM8進行數據預處理。去除前10個時間點的數據。對剩余170個時間點數據進行層面時間校正和時間點之間的頭動校正（去除三維平移超過2 mm、三維旋轉超過2°的受試者數據）。此外，計算不同時相之間頭動位置的改變，即幀位移量（framewise displacement，FD），以反映某幀圖像相對于前一個時間點的平均位移量。隨后對每個受試者的結構像和功能像線性配準。采用3 mm再采樣進行歸一化，并將個體頭像配準到MNI（montreal neurological institute）標準空間。通過線性回歸，去除頭動、腦白質及腦脊液的平均信號。在0.01～0.08 Hz頻率范圍內，通過帶通濾波去掉數據的線性漂移和高頻背景噪聲等非生理信號。

1.5.2 全腦FCD計算 經過時間校正、頭動校正及空間標準化后的數據用于計算FCD?；赯hang等［9］研究，通過Linux平臺的內部腳本計算FCD值，即某一體素與全腦其余灰質體素間存在功能連接的個數?；驹硎钱攦蓚€體素的時間序列Pearson相關系數大于0.6時，認為兩個體素間存在功能連接。在全腦灰質模板內得到每個體素FCD值后，除以全腦的平均FCD值，得到每個受試者標準化的全腦FCD（global FCD，gFCD），并利用全寬半高（full-width at half-maximum，FWHM）為8 mm的高斯核進行空間平滑，進一步提高數據的正態分布性。

1.6 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件包分析數據。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對所有連續變量數據進行正態性檢驗，所有數據均符合正態分布。連續變量數據組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。分類變量組間比較采用χ2檢驗。將性別、年齡、受教育年限作為協變量，采用獨立樣本t檢驗比較C基因攜帶者和TT純合子攜帶者之間的差異，得到組間差異的gFCD腦區。該結果需要進行蒙特卡洛模擬（Monte Carlo simulation）校正，校正的方法及參數為：每個體素閾值設定在P＜0.001，團塊大小為≥64個體素時認為差異有統計學意義（相當于校正后閾值達到P＜0.05的效果），校正后的gFCD腦區作為最終結果。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人口學、基因及行為學數據 通過KIBRA基因分型檢測，267例受試者中，TT、TC、CC基因型攜帶者分別為155例（58.05%）、99例（37.08%）、13例（0.05%），T、C等位基因頻率為76.05%和23.41%；112例為C基因攜帶者，即TC+CC，基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.310，P＞0.05）。

TC+CC基因型組和TT型組間年齡、性別和受教育年限差異無統計學意義（均P＞0.05）。韋氏記憶量表中，TC+CC基因型組代表長時記憶測試的積累分測驗得分高于TT基因型組（P=0.05），不同基因型組間其余各項測驗評分及記憶商數差異無統計學意義（P＞0.05）。威斯康星卡片分類試驗中，不同基因型組間代表執行功能的持續性錯誤百分比差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 基因型組間的全腦FCD分析 KIBRA C基因攜帶者（TC+CC）與TT純合子攜帶者間gFCD存在差異的腦區為右側枕中回（圖1A，峰值點MNI坐標x=27，y=-75，z=36，團塊大小64個體素，峰值點T值=4.139；校正后P＜0.05）。相對于TT純合子攜帶者，C基因攜帶者的FCD值增高（圖1B）。

3 討論

本研究對AD候選基因KIBRA在天津地區健康漢族人群中腦功能連接密度的影響進行了探索性研究。結果表明，KIBRA不同基因型間存在記憶評分和腦功能的差異，TT純合子攜帶者的長時記憶好于C基因攜帶者；兩個基因型的差異腦區為枕中回，C基因攜帶者的腦功能激活程度高于TT純合子攜帶者。

Tab.1 Comparison of demographic and behavior data between genotypic subgroups表1 不同基因型受試者人口學及行為學數據的比較

Fig.1 Significant FCD difference found in right occipital gyrus in KIBRA genotypic subgroups圖1 右側枕中回的FCD存在KIBRA不同基因型間表達差異

3.1 影像遺傳學與AD 近年來，快速發展的影像遺傳學將功能影像學和遺傳學方法相結合，將腦功能作為中間表型，相比于單純行為學評價的表型更能直接反映基因功能，為研究基因多態性對大腦功能及行為的潛在作用提供了獨特的視角。FCD是一種不依賴腦圖譜模板來構建腦網絡的功能影像學方法，計算每個體素與全腦體素存在功能連接的數目，從全局角度發現功能連接數目最多的節點。該方法不依賴腦圖譜模板來構建腦網絡，可以更全面、客觀地反映全腦信息，適合對機制不明的中樞神經系統退行性疾病進行探索性研究（如AD）。遺傳因素在AD的發生中起重要作用，且具有不隨時間病程變化而改變的特點，影像遺傳學可作為早期識別AD的一種研究手段。已有研究顯示，AD候選基因KIBRA在AD的重要腦區海馬和顳葉高表達，KIBRA基因多態性與AD危險存在正相關。

3.2KIBRA基因多態性對行為學、腦功能的影響 本研究發現，KIBRATT純合子攜帶者的長時記憶好于C基因攜帶者，這里所說的長時記憶仍屬于短期記憶的范疇，應區別于AD患者長期記憶保留特點中的長期記憶概念，TT純合子和C基因攜帶者這兩個基因型間行為學的差異可能與KIBRA基因單核苷酸多態性有關。KIBRA基因單核苷酸多態性表現在等位基因T→C堿基轉換。正常表達情況下，KIBRA基因編碼的蛋白位于染色體5q35.1上，包含1 113個氨基酸，其中第953～996氨基酸區是與蛋白激酶Cζ（PKCζ）的結合區，PKCζ水解形成的異構體蛋白激酶M是維持后期長時程增強作用（LTP）的必要條件［10-11］。LTP是突觸可塑性的表現形式，而人類記憶的重要神經基礎為突觸可塑性。因此，KIBRA對維持持久性記憶，而且很可能對維持長期記憶都是重要的。當發生T→C堿基轉換后，影響上述過程的正常進行，推測可能是C基因攜帶者的長期記憶存在潛在損傷的原因。無論是亞洲人群還是歐美人群［1-5］，KIBRAT基因攜帶者在言語記憶、情景記憶、瞬時記憶及短時延遲記憶的表現優于CC攜帶者，提示C基因型可能影響記憶功能。

另外，本研究發現，靜息狀態下長時記憶較差的C基因攜帶者的FCD值高于TT純合子攜帶者。對于KIBRA基因多態性影響腦功能的研究有多種發現。一項針對歐美高加索健康青年人的任務態影像遺傳研究發現，選擇記憶評分一致的CC基因型和T等位基因攜帶者兩組中，CC攜帶者出現激活腦區，推測可能的原因是為了維持同等水平的行為學功能，出現腦功能的代償激活［1］。而對歐美高加索老年人的任務態研究認為，T基因攜帶者記憶評分較好，同時發現腦區激活增加，是由于該腦區功能強的原因［3］。對亞洲青年人群的研究則發現，C基因攜帶者默認網絡中的多個腦區同步一致性增加，但同時網絡內的部分腦區灰質體積減小，可能存在腦結構-功能代償［5］。存在以上結果差異的原因可能有兩點：第一，KIBRA不同基因型的腦功能表現受年齡影響，目前文獻報道較少，需要更多的研究驗證；第二，不同種族人群KIBRA基因型分布不同，例如T等位基因在歐洲高加索人的頻率約為25%，在非裔美國人群約為50%［1］，而在亞洲人群中卻占到近75%，這也是本研究中將TT純合子作為一組、C等位基因攜帶者作為另一組的依據。

3.3 枕葉與AD相關基因關系 本研究中，KIBRA基因單核苷酸多態性影響腦功能改變的腦區是枕中回。AD尸檢神經病理結果顯示，淀粉樣蛋白被認為是AD標志物，枕葉皮質是該淀粉樣蛋白早期出現的腦區之一［12］。影像學上有相關的研究證實，AD患者枕葉具有結構、靜息態和任務態功能及功能網絡的損傷。例如，AD患者的枕葉灰質體積減少，且與大腦靜息狀態默認網絡的功能連接減低有關［13］。另一項早期AD患者的腦網絡與任務表現有效性關系的研究顯示，表現有效性高的AD患者在顳枕葉腦區出現了增強的腦功能連接度，而這種增強的表現被認為是一種對神經退變的代償機制［14］。另外，枕葉的靜息狀態出現α節律被認為是輕度認知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）的重要腦電圖（electroencephalographic，EEG）標志，早期AD的認知功能和灰質密度與枕葉的α節律的幅度呈正相關［15］。正電子發射計算機斷層顯像（PET-CT）研究發現，為了維持較好的定向能力，AD患者的枕中回代謝增加［16］。更進一步研究顯示，在AD的早期階段MCI患者中，攜帶載脂蛋白E（ApoE）ε4基因的MCI-AD轉歸者具有更顯著的枕葉萎縮，而非ApoEε4基因的MCI-AD轉歸者僅有額頂葉體積的減少［17］。以上研究提示，在AD的早期及晚期階段均有枕葉的受累，表現為體積的減少及功能的減退。ApoEε4基因能增加晚發型AD的風險或年齡相關的認知功能減退，該基因被認為是AD的風險基因。一項研究納入了26～45歲的正常中青年人群，通過比較攜帶ApoEε4基因與非攜帶者的腦灰質體積發現，攜帶ApoEε4基因人群的枕葉皮質灰質體積相對增加［18］。且本研究發現KIBRAC基因攜帶者的FCD增高。這些研究反映了在AD發生之前，長期存在的基因差異可持續性地影響腦結構和功能，這些結構和功能的改變可能會最終導致AD候選基因攜帶者在步入老年時易患AD。

3.4 局限性及展望 本研究存在一定的局限性。首先，雖然入組人數已達到近300例，但是對于影像遺傳研究來說，單個等位基因的樣本量仍顯不足；最終入組的受試者主要是天津地區的漢族大學生人群，在不同地區、種族間有無差異需進一步擴大樣本量并驗證當前研究的結果。其次，KIBRA基因為AD候選基因，因此下一步的研究對象將擴展為老年人及AD患者。最后，本研究結果顯示KIBRA不同基因型間只有右側枕中回的FCD存在差異，其原因未明，我們會進一步擴大樣本量并驗證左、右兩側枕中回FCD的差異。

綜上，本研究探討了天津地區健康漢族青年人群KIBRA基因多態性對認知及腦功能的影響，有助于發現AD遺傳風險因素造成記憶功能損害的神經機制，為建立早期識別AD風險人群的遺傳及影像學指標奠定基礎。

［1］Papassotiropoulos A，Stephan DA，Huentelman MJ，et al.Common Kibra alleles are associated with human memory performance［J］.Science，2006，314（5798）：475-478.doi：10.1126/science.1129837.

［2］Yasuda Y，Hashimoto R，Ohi K，et al.Association study of KIBRA gene with memory performance in a Japanese population［J］.World J Biol Psychiatry，2010，11（7）：852-857.doi：10.3109/15622971003797258.

［3］Kauppi K，Nilsson LG，Adolfsson R，et al.KIBRA polymorphism is related to enhanced memory and elevated hippocampal processing［J］.J Neurosci，2011，31（40）：14218-14222.doi：10.1523/JNEUROSCI.3292-11.2011.

［4］Witte AV，K?be T，Kerti L，et al.Impact of KIBRA polymorphism on memory function and the hippocampus in older adults［J］.Neuropsychopharmacology，2016，41（3）：781-790.doi：10.1038/npp.2015.203.

［5］Wangd，Liu B，Qin W，et al.KIBRA gene variants are associated with synchronization within the default-mode and executive control networks［J］.Neuroimage，2013，69：213-222.doi：10.1016/j.neuroimage.2012.12.022.

［6］Werschingh，Guske K，Hasenkamp S，et al.Impact of common KIBRA allele on human cognitive functions ［J］.Neuropsychopharmacology，2011，36（6）：1296-1304.doi：10.1038/npp.2011.16.

［7］Burgess JD，Pedraza O，Graff-Radford NR，et al.Association of common KIBRA variants with episodic memory and AD risk［J］.Neurobiol Aging，2011，32（3）：557.e1-9.doi：10.1016/j.neurobiolaging.2010.11.004.

［8］Sédille-Mostafaie N，Sebesta C，Huber KR，et al.The role of memory-related gene polymorphisms，KIBRA and CLSTN2，on replicate memory assessment in the elderly［J］.J Neural Transm（Vienna），2012，119（1）：77-80.doi：10.1007/s00702-011-0667-9.

［9］Zhang N，Liuh，Qin W，et al.APOE and KIBRA interactions on brain functional connectivity in healthy young adults［J］.Cereb Cortex，2017，27（10）：4797-4805.doi：10.1093/cercor/bhw276.

［10］Tracy TE，Sohn PD，Minami SS，et al.Acetylated tau obstructs KIBRA-mediated signaling in synaptic plasticity and promotes tauopathy-related memory loss［J］.Neuron，2016，90（2）：245-260.doi：10.1016/j.neuron.2016.03.005.

［11］吳靜，楊睿，劉樹業.蛋白激酶C抑制劑的研究新進展［J］.天津醫藥，2016，44（1）：114-117.Wu J，Yang R，Liu SY，et al.New progress in the study of protein kinase C（PKC）inhibitors［J］.Tianjin Med J，2016，44（1）：114-117.doi：10.11958/20150079.

［12］Braakh，Braak E.Neuropathological stageing of Alzheimerrelated changes［J］.Acta Neuropathol，1991，82（4）：239-259.

［13］Hafkemeijer A，M?ller C，Dopper EG，et al.Resting state functional connectivity differences between behavioral variant frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease［J］.Front Hum Neurosci，2015，9：474.doi：10.3389/fnhum.2015.00474.

［14］De Marco M，Duzzid，Meneghello F，et al.Cognitive efficiency in Alzheimer’sdisease isassociated with increased occipital connectivity［J］.J Alzheimers Dis，2017，57（2）：541-556.doi：10.3233/JAD-161164.

［15］Babiloni C，Del Percio C，Boccardi M，et al.Occipital sources of resting-state alpha rhythms are related to local gray matter density in subjects with amnesic mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2015，36（2）：556-570.doi：10.1016/j.neurobiolaging.2014.09.011.

［16］Weissberger GH，Melrose RJ，Fanale CM，et al.Cortical metabolic and cognitive correlates of disorientation in Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2017，60（2）：707-719.doi：10.3233/JAD-170420.

［17］Morgen K，Fr?lich L，Tosth，et al.APOE-dependent phenotypes in subjects with mild cognitive impairment converting to Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2013，37（2）：389-401.doi：10.3233/JAD-130326.

［18］Alexander GE，Bergfield KL，Chen K，et al.Gray matter network associated with risk for Alzheimer’s disease in young to middleaged adults［J］.Neurobiol Aging，2012，33（12）：2723-2732.doi：10.1016/j.neurobiolaging.2012.01.014.