秦嶺地區野生山丹遺傳多樣性表型及ISSR分析

丁芳兵， 孫偉博， 原雅玲， 尋路路， 張 蕾

(1.陜西省西安植物園/陜西省植物研究所，陜西西安 710061； 2.南京林業大學，江蘇南京 210037)

秦嶺山區及周邊地區百合資源豐富。近年來，有許多關于秦嶺地區川百合、卷丹、野百合等百合群體形態學水平上遺傳多樣性的研究報道，這些種在群體內或群體間具有豐富的多態性，主要表現在生長、形態存在顯著差異[1-5]。遺傳多樣性是指種內不同種群之間或同一種群不同個體間的遺傳變異總和，除去個體水平上的形態發育差異，還包括細胞水平上的染色體差異及分子水平上的核酸、蛋白差異等。育種需要足夠性狀遺傳多樣性的種質資源，而分子生物學的發展為學者研究種質資源遺傳多樣性提供了更便捷、更精確的方法，目前，分析百合群體遺傳多樣性與親緣關系的主要技術有即隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)、內部簡單序列重復(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)等[6-8]，其中ISSR標記重復性比RAPD好，操作簡單、快速高效，且無需測序，是較適合百合研究的一項分子標記技術。

山丹(Liliumpumilum)作為藥食兩用百合，具有抗寒、抗旱、抗鹽堿等多種優良性狀，在秦嶺地區廣有分布，是百合雜交育種的優良親本。目前，對秦嶺地區山丹遺傳多樣性的研究非常有限，而利用表型性狀和ISSR技術研究山丹不同居群的遺傳多樣性，不僅可以為分析山丹進化演變提供重要參考，而且可篩選出山丹不同居群的優良變異性狀，為秦嶺地區山丹資源的保護和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自秦嶺山周邊的營盤鎮、佛坪縣、小峪、大峪口、太白縣等地，共計9個居群，分別于2013、2014年5—9月在秦嶺山區及周邊地區采集共計30余次，每個居群采樣個體數30個，個體間避免為同一無性系。各采樣點詳細信息見表1。

表1不同居群山丹采樣點信息

1.2 試驗方法

1.2.1 表型性狀調查 采用游標卡尺測量山丹的花柱長度、花絲長度、莖粗、鱗莖最寬處直徑，使用米尺測量株高。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用天根生化科技(北京)有限公司生產的植物基因組DNA提取試劑盒，提取植株鱗莖最外部鱗片的DNA；提取的DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA樣品于-20 ℃冰箱內保存，備用。

1.2.3 PCR擴增和電泳 初篩選出25條引物，由上海Invitrogen(英駿)生物技術有限公司進行合成；每個居群隨機選擇2個模板進行擴增，最終選擇P1：5′-CTCTCTCTCTCTCT TGA-3′、P2：5′-CTCTCTCTCTCTCTTAG-3′、P3：5′-CTCTC TCTCTCTCTTGT-3′這3條特征帶清晰的引物進行PCR擴增。反應體系為20 μL：20～25 ng模板DNA 1 μL，Taq酶 0.5 μL，10 μmol/L ISSR引物 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×buffer 4 μL，加ddH2O至20 μL。 PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，染色后進行條帶分析。

1.3 數據處理與統計

表型性狀數據采用SPSS 19軟件進行分析比對。ISSR結果在100～2 000 bp范圍內選取重復性良好且清晰的條帶進行記錄統計，相同分子量片段對應1個多態性位點，有特異性條帶的記為1，沒有的記為0。

2 結果與分析

2.1 居群間表型性狀變異分析

由表2可見，5個表型性狀中，山丹居群SD3的植株相對最高、花柱相對最短、鱗莖最寬直徑相對最大，居群SD1的植株相對最矮、鱗莖最寬直徑相對最小，居群SD8的花絲相對最短，與其他居群差異顯著(P<0.05)；在莖粗指標上，9個居群差異不顯著，表明其遺傳穩定性相對較高；居群SD3、SD8的花柱長度、株高、鱗莖最寬直徑與其他居群相比差異顯著(P<0.05)。相關性分析結果表明，5個表型性狀僅在某些居群中存在相關性，如居群SD1、SD2、SD3、SD5、SD7的株高與莖粗呈正相關，居群SD1、SD3、SD8的花柱、花絲長度與鱗莖最寬直徑呈負相關，居群SD4、SD5的花柱、花絲長度與鱗莖最寬直徑呈正相關，表明5個表型性狀在9個居群間的相關性不高，居群特異性明顯。方差分析結果表明，居群內各指標的差異不顯著。

表2山丹9個居群的表型性狀cm

注：同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 表型性狀與地理環境因子的相關性

由表3可見，僅花絲長度與生長環境呈負相關，其他4個表型性狀與生長環境呈正相關；花柱、花絲長度與緯度及海拔呈負相關，而株高、莖粗、鱗莖最寬直徑與海拔呈正相關，莖粗、鱗莖最寬直徑與緯度呈負相關，株高與緯度呈微弱的正相關，大部分相關性未達顯著性，僅花絲長度與經度呈顯著正相關(P<0.05)，表明地理因素對大部分表型性狀無決定性影響。

表3表型性狀與地理環境相關性分析

注：“*”表示顯著相關。

2.3 表型聚類分析

由圖1可見，當遺傳進化距離L=2時，野生山丹9個居群中除SD1、SD3、SD8為3個獨立居群外，可以將其他居群分為1個大類，其中居群SD3、SD8生長環境不同，但海拔差異相對較??；在分為1大類的6個居群中，居群SD5與其他5個居群生長環境有明顯差別，這可能是由于山丹在秦嶺地區的遷徙經歷海拔的變化，而遷徙線路環境的變化又造成山丹分布的生態多樣性，同時，在遷徙過程中，也造成相對獨立生態居群的產生。

2.4 ISSR多態性分析

由圖2可見，從25條引物中篩選出的3條引物用于PCR擴增，條帶數多且清晰。由表4可見，3條引物擴增片段的多態性比例平均值分別為44.1%、40.3%、49.0%，引物擴增多態性相對較低；不同引物擴增的多態性存在差異，說明山丹材料遺傳背景具有一定的復雜性；所有樣品共檢測到522個位點，其中多態性位點235個，多態性比例為45.0%；3條引物居群內多態性位點比例在36.5%～55.2%之間，9個居群中SD1遺傳多樣性水平相對最高，SD4遺傳多樣性水平相對最低。

2.5 ISSR分子標記聚類分析

由圖3可見，9個山丹居群根據ISSR標記結果可聚分為2個大類，居群SD1、SD3、SD6、SD8表現為相對獨立的居群，居群SD6與SD4、SD5的親緣關系相對更近，SD8與SD2、SD7、SD9的親緣關系相對更近。結合地理因子分析發現，山丹多樣性變化的主要原因是海拔的改變，其次是隨經緯度的改變而不同，但表型性狀與地理因子的相關性不顯著。

表43條引物的ISSR擴增結果

3 討論

秦嶺地區山丹居群大多數材料能夠依據地理來源相對集中地聚在一類，如分別來自佛坪縣(SD2)、戶縣東澇峪(SD6)的山丹居群海拔相近，分別來自長安區大峪(SD4)、太白縣(SD5)、秦嶺祥峪(SD7)、商洛縣西柿溝(SD9)的4個居群緯度相近，且均分布在高海拔地區。同一類中居群有地理因子相差較大的，如SD4、SD9這2個居群的經度與SD5居群相差相對較遠，這可能是起源相同的群體生長環境不同造成的。ISSR聚類分析結果表明，山丹居群聚類與地理分布的關系不很明顯，這與葛新新等的研究結果[9]較為一致，這種相關性的不顯著可能是由于采集地基本在秦嶺附近，采樣區域經緯度變化幅度有限，生態環境差異對遺傳變異影響相對較小，有限的范圍可能造成較多的基因交流，另外，對小生境的記錄欠缺及利用鱗莖最寬直徑進行ISSR標記可能技術不完善，都會造成這種結果。不過，山丹表型性狀與地理因子有一定的相關性，特別是花絲長度與經度呈顯著正相關(P<0.05)，說明按經度分布可能是山丹的一條遷徙路線。ISSR聚類結果表明，居群SD7與SD9親緣關系相對較近，這兩者在地理環境因素上比較相似，結合地理因子可以推斷，秦嶺地區山丹變異的首要因素可能是海拔的變化。

秦嶺地區山丹資源豐富，能為我國山丹的育種栽培、種質改良創新提供大量原始材料，對這些野生山丹資源進行調查、收集和保存，能為將來秦巴山區山丹百合資源的分類提供依據，對山丹的引種保護及馴化栽培起到指導作用。當前，有不少百合研究工作者對秦嶺地區山丹資源進行了相關調查與收集，但對遺傳等問題未做深入研究，有的僅單獨運用傳統形態學歸類法或ISSR分子標記技術，缺少對2種方法的綜合運用。本研究綜合利用形態學歸類法和ISSR分子標記這2種方法，能更完善地解釋秦嶺地區山丹資源的遺傳特性，可為將來秦巴山區的百合資源調查研究及開發利用提供重要依據。

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