體外培養鴿嗉囊組織形態學、酶活力及基因表達動態變化規律

萬雪萍，謝 鵬，卜 柱，湯青萍，鄒曉庭*

（1.浙江大學動物科學學院，浙江省飼料與動物營養重點實驗室，農業部（華東）動物營養與飼料重點實驗室，浙江大學動物分子營養學教育部重點實驗室，浙江杭州 310058；2.中國農業科學院家禽研究所，江蘇揚州 225125；3.淮陰師范學院生命科學學院，江蘇淮安 223001）

嗉囊是鳥類儲存和軟化食物的重要場所，同時也是抵御病原體入侵的功能性屏障，在鳥類先天免疫系統調節中扮演重要角色[1]。不同于其他家禽，鴿嗉囊還具有類似于哺乳動物乳腺的“泌乳”功能。在育雛期，嗉囊受催乳素作用，上皮細胞積聚營養物質并發生角質化，最終脫落形成“鴿乳”[2]。作為理想的實驗靶器官，近十年來鴿嗉囊已在流行病學、組織生理學及禽類營養與分子育種等領域得到廣泛研究，然而大多數研究主要集中于體內試驗，體外試驗鮮有報道[3-4]。與動物體內試驗相比，體外試驗具有試驗周期短、成本低、環境因子可控等優點[5]，其中，組織培養技術可以較好地模擬體內的環境狀態和營養物質交換情況，有利于從整體水平評估外界因素對靶器官的影響[6]。研究人員已成功運用組織體外培養技術完成對犢牛睪丸、鴿小腸等組織的體外培養，并且通過檢測體外培養組織形態學和酶活指標的變化探索出最佳的體外給藥時間[7-8]。目前，國內外關于鴿嗉囊組織體外培養尚未見報道，其在離體培養條件下的動態變化規律有待于揭示。鑒于此，本研究采集鴿嗉囊組織進行體外培養，檢測體外培養0～7 d鴿嗉囊組織形態學、Caspase-3酶、琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶和總ATP酶活力及Bcl-2、Bak1和角蛋白19（CK-19）基因表達的變化，旨在揭示體外培養環境下鴿嗉囊組織活性變化規律，并探索其體外培養的適宜時間，為今后開展以鴿嗉囊為載體的營養學、生理學及病理學等體外試驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源 60周齡健康哺育期美國王鴿，采集嗉囊組織。試驗動物購自江陰市威特凱鴿業有限公司。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM/F-12和青鏈霉素均購自美國Gibco公司，牛胰島素、皮質醇和表皮生長因子均購自美國Sigma公司，PBS緩沖液、4%多聚甲醛、無水乙醇、95%乙醇、伊紅、蘇木紫、中性樹脂、二甲苯均購自中國北京索萊寶科技有限公司，Caspase-3酶、琥珀酸脫氫酶（SDH）及ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶以及總ATP酶）活性測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，瓊脂糖和Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司，ReverTra Ace?反轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自中國大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設備 Galaxy 系列二氧化碳培養箱（英國RS Biotech 公司），SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），高壓滅菌鍋（ZDX-35BI型，座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器），一次性培養瓶（Costar，美國），切片機（Leica，德國），光學顯微鏡（尼康，日本），Mx3000P熒光定量PCR儀，分光光度計（UV-2000，Unico，Instruments，上海，中國），Champ GelTM 5000 型凝膠成像系統（Vilber，法國），ND-1000核酸/蛋白濃度測定儀（Wilmington，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗉囊組織分離培養 取60周齡哺育期美國王鴿4只，采集嗉囊組織，PBS沖洗，放入組織清洗液（500 mL PBS+5 mL 100 U/mL青鏈霉素）低溫帶入無菌操作室。在超凈工作臺中用組織清洗液沖刷嗉囊樣本3遍，隨后放入組織浸泡液（40 mL PBS+2 mL 100 U/mL青鏈霉素）中浸泡20 min，浸泡完畢后，移入組織清洗液中沖洗3遍。剝離脂肪、結締組織及表皮組織，將剩余組織剪成2～3 mm3大小，均勻接種于培養瓶中，加入5 mL培養液（DMEM/F12+5%胎牛血清+100 U/mL青鏈霉素+0.5 μg/mL皮質醇+10 ng/mL表皮生長因子+5 μg/mL牛胰島素），于37℃、5%CO2細胞培養箱中連續培養7 d，間隔24 h更換1次培養液。于培養第0、1、2、3、4、5、6、7天收集組織塊進行形態學、酶活力及基因表達檢測。

1.2.2 組織形態學觀察 取嗉囊組織放置4%多聚甲醛中固定24 h后，采用常規方法脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色、透明、封片、光學顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3 組織酶活力測定 采用酶活測定試劑盒檢測組織Caspase-3、琥珀酸脫氫酶（SDH）及ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶以及總ATP酶）活力。試劑配制和試驗操作遵照公司說明書進行。本試驗通過計算試驗組OD405nm/陰性對照組OD405nm來確定Caspase-3的活化程度。

1.2.4 熒光定量PCR反應檢測Bcl-2、Bak 1和CK-19基因表達 用Trizol法抽提各時間點組織塊總RNA并檢測其濃度、純度以及完整性。取2 μg RNA反轉錄制備cDNA模板，構建熒光定量PCR體系（20 μL）。反應條件：95℃變性30 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共40個循環。參照GenBank數據庫中鴿基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計熒光定量PCR引物，引物信息見表1。以β-actin基因為內參，并以 2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.3 統計分析 本試驗中所有數據均采用SPSS 20.0 軟件的One-Way ANOVA進行統計分析，結果以平均值±標準誤表示。P＜0.05表示為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 鴿嗉囊組織體外培養0～7 d形態學觀察 如圖1所示，體外培養第0～4天，鴿嗉囊組織層次結構清晰，上皮基層和棘層細胞胞質增多，細胞核染色逐漸變淺，細胞排列緊密，上皮淺層結構完整（圖1a～e）。體外培養5 d后，嗉囊組織層次結構逐漸模糊，上皮基層和棘層細胞排列逐漸松散，上皮淺層出現凋落。體外培養7 d，嗉囊上皮基層和棘層細胞呈零散分布，嗉囊組織正常形態結構基本消失（圖1f～h）。

表1 熒光定量PCR反應引物序列

圖1 鴿嗉囊組織體外培養0～7 d形態學觀察（20×，標尺為 500 μm）

2.2 鴿嗉囊組織體外培養0～7 d酶活力檢測 如表2所示，鴿嗉囊組織Caspase-3酶活性于培養第1天顯著升高至峰值（P＜0.05），隨后于培養第2～4天維持穩定水平，體外培養5 d后其活性顯著升高（P＜0.05）。SDH酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活性均于體外培養第1天顯著降低隨后顯著提高（P＜0.05）。SDH酶活力于培養第2～4天顯著高于培養第5～7天（P＜0.05）。Na+-K+-ATP 酶以及 Ca2+-Mg2+-ATP酶均于體外培養第2～4天維持較高活性，隨后于體外培養第7天降至最低水平（P＜0.05）?？侫TP酶活性于體外培養第3天顯著升高至峰值，于培養第5～7天活性顯著受抑制（P＜0.05）。

2.3 鴿嗉囊組織體外培養0～7 dBcl-2、Bak1和CK-19基因表達變化 由表3可知，鴿嗉囊組織Bcl-2和CK-19基因表達均于體外培養第1 天顯著下調（P＜0.05）。隨后，Bcl-2基因表達于體外培養第2～4天顯著升高（P＜0.05），于體外培養5 d后顯著降低（P＜0.05）。CK-19基因表達于體外培養第4天升高至峰值，隨后于體外培養第6～7天顯著降低（P＜0.05）。鴿嗉囊組織Bak1基因于體外培養第1天表達顯著上調（P＜0.05），隨后穩定至體外培養第5天（P＞0.05），并于培養第6～7天其表達再次顯著上調（P＜0.05）。

表 3 體外培養0～7 d鴿嗉囊組織基因表達變化（n=3）

3 討 論

組織體外培養能夠在原生基質中維持細胞的活性，并保留細胞與細胞及細胞與基質間的相互作用，從而為觀察組織在外界刺激下的形態學變化、內環境因子調控過程等創造了良好的試驗技術手段[9]。本研究以體外培養鴿嗉囊組織為基礎，動態檢測了離體條件下組織的形態學、酶活力及基因表達變化。與前人報道的體內試驗結果類似[10]，本試驗中，體外培養前期（體外培養1～4 d）鴿嗉囊組織上皮層結構完整且細胞胞質逐漸增多，表明鴿嗉囊組織細胞在離體培養條件下仍維持細胞增殖的活性，且具有合成胞內物質的能力。體外培養5 d后鴿嗉囊組織結構迅速崩解，可能是由于部分細胞死亡導致。

表2 體外培養0～7 d鴿嗉囊組織酶活力變化（n=3） U/mg pro

Caspase-3是調控細胞凋亡的關鍵酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起著樞紐作用。體外培養細胞促凋亡試驗過程中，Caspase-3酶活力顯著增加[11]。本試驗中，Caspase-3酶活力于培養第1天顯著升高至峰值，于體外培養5 d后酶活再次顯著升高，由此推測鴿嗉囊組織進入體外培養系統時可能經歷了一段時間的適應過程，并且組織于體外培養后期可能處于細胞凋亡活躍階段。SDH為線粒體電子傳遞系統的一種三羧酸循環酶，是反映線粒體功能的標志酶之一。在動物受損組織中，SDH活力顯著受抑制[12]。本研究中，鴿嗉囊組織SDH活力于體外培養第5～7天顯著低于培養第2～4天，推測體外培養的鴿嗉囊組織代謝活動于4 d后顯著受抑制。ATP酶是衡量細胞生理狀況的重要指標，其主要功能是水解ATP、釋放能量、離子運輸等。機體的ATP酶主要分為Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶2種。Na+-K+-ATP酶維持著細胞膜兩側的膜電位，調節細胞滲透壓，為營養物質的吸收提供動力；Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化影響細胞的分泌與增殖。鈣離子平衡失調的體外培養系統中，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶均顯著下調[13]。本試驗中，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活力在體外培養第1天均顯著降低，隨后均于培養2～4 d維持于高酶活水平，并于體外培養5～7 d再次顯著下降，筆者推測，體外培養鴿嗉囊組織在進入體外環境時其細胞膜經歷了離子轉運穩態的失調，隨后恢復較好的穩態并維持至培養第4天，培養5 d后內環境穩態再次失衡。本試驗中，離體培養鴿嗉囊組織ATP酶活力變化與其形態學改變趨勢相吻合，這可能是由于ATP酶活力的變化影響了細胞能量代謝及細胞膜內外離子平衡過程，導致細胞的形態結構和生理功能的改變。

Bcl-2家族通過維持線粒體膜的穩定性來影響細胞內源性凋亡，其家族成員根據功能一般可分為抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡（如 Bax、Bak）2類[14]。本試驗中體外培養鴿嗉囊組織Bcl-2基因表達于培養第1、5、6、7天顯著低于其他時間，Bak1基因表達隨培養時間呈上調趨勢，結合形態學及Caspase-3酶活變化規律，研究結果進一步表明體外培養4 d后鴿嗉囊組織細胞凋亡過程顯著加快。細胞角蛋白（CKs）是上皮類細胞重要的標志，角蛋白在鴿嗉囊角質化產乳過程中具有重要作用[15]。本試驗中，CK-19基因于體外培養第2～4天顯著上調，隨后于體外培養6～7 d顯著下調，這可能與嗉囊上皮細胞增殖及角質化過程有關[2]。

4 結 論

體外培養鴿嗉囊組織的形態學、Caspase-3酶、琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+- ATP酶和總ATP酶活力及Bcl-2、Bak1和CK-19基因表達隨培養時間延長呈現規律性變化。本試驗條件下，鴿嗉囊組織體外培養活性的最佳時間為4 d。

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