野生獼猴桃與維生素C對大鼠酒精性肝腦損傷的預防性保護作用

陳霞，張銳，胡鍇，羅婷婷，郭文博，楊艷

（1.西南醫科大學公共衛生學院預防醫學專業，四川瀘州 646000）（2.西南醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，四川瀘州 646000）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）為獼猴桃屬（Actinidia Lindl）植物，又稱狐貍桃、藤梨、羊桃、木子、毛木果和奇異果等。其果實營養豐富、風味獨特，在世界上消費量最大的前26種水果中，獼猴桃的營養最為豐富全面，含有人體必需的多種氨基酸和礦物質，尤其維生素C含量十分豐富，被稱為水果中的“維生素C之王”。在我國，野生獼猴桃主要分布在黑龍江地區、兩廣地區、秦嶺北麓、浙江東部、貴州西南、四川川南以及河南等地，產量巨大，品種豐富。野生獼猴桃中各營養及功能成分含量均高于市面上出售的人工培植的獼猴桃[1]。由于其長在荒無人煙的深山中，交通不便，采摘困難，加之口感偏酸，僅有少數當地人食用，絕大部分野生獼猴桃資源沒有被利用，十分可惜，因此，合理開發使用這寶貴資源非常必要。

過量飲酒及酗酒對人類健康的危害正成為日益嚴重的社會問題，長期大量飲酒可導致人體多器官、多系統損害，其中以肝、腦受損最為嚴重[2]。研究表明，酒精可通過不同的機制導致脂質過氧化反應、氧化應激和細胞凋亡引起肝腦損傷[3,4]。由于目前尚無治療酒精中毒所致肝腦損傷的有效藥物，因而近年來如何防治酒精性肝腦損傷已成為研究熱點。維生素C和獼猴桃提取物均具抗氧化、脂質過氧化的作用[5]。研究采用酒精灌胃法建立大鼠酒精性肝腦損傷模型，分別給予野生獼猴桃飼料和添加等量維生素C的維生素C強化飼料干預，比較二者對大鼠酒精性肝腦損傷的預防性保護作用，為野生獼猴桃在藥用、營養及保健方面的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40只SD雄性健康大鼠，體重180～220 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證SCXK(川)2013-17；實驗動物使用許可證SYXK(川)2013-065。

1.1.2 主要儀器與試劑

Versamax連續波長酶標儀，美國分子儀器公司；UV-2450紫外-可見分光光度計，日本島津公司；5810R冷凍型臺式大容量高速離心機，德國eppendorf公司；LD4-2A型臺式低速離心機，北京眾益中和生物技術有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

56°紅星二鍋頭白酒，北京紅星股份有限公司；四川省宜賓縣野生獼猴桃；維生素C，純度99%，北京索萊寶科技有限公司；谷丙轉氨酶(Alaninea minotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate transaminase，AST)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Serum total cholesterol，TC）、過氧化脂質（Lipid Peroxidation，LPO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、總蛋白（Total protein，TP）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

大鼠適應性喂養一周后，將40只SD大鼠按體重隨機均分為4組，分別為正常組、模型組、維生素C組（以下簡稱Vc組）和野生獼猴桃組（以下簡稱獼猴桃組）。

1.2.2 飼料的制備

1.2.2.1 野生獼猴桃飼料的制備

野生獼猴桃飼料制備參照張燕[6]等的方法進行。將野生獼猴桃洗凈去皮打成果漿，以30%的比例與粉末狀普通大鼠飼料混勻成糊狀，用10 mL注射器制成大小適度均一的飼料，自然風干，低溫儲存。

1.2.2.2 維生素C強化飼料的制備

檢測四川省宜賓縣野生獼猴桃維生素 C含量為1200 mg/kg，野生獼猴桃含水量為50%，30%獼猴桃飼料因添加獼猴桃維生素C增加的量約為420 mg/kg，因此，按420 mg/kg將維生素C添加到粉狀普通飼料中制成維生素C強化飼料。

1.2.3 造模與干預

張宇等采用白酒灌胃2周造成大鼠酒精性肝腦損傷[7,8]，因此實驗采用白酒灌胃2周造模：除正常組給予等量生理鹽水灌胃外，其余各組連續灌胃56 °紅星二鍋頭建立酒精性肝腦損傷模型（第一周白酒劑量為8 mL/kg，第二周為10 mL/kg），每天1次，同時正常組、模型組給予普通飼料，Vc組和獼猴桃組分別給予維生素C強化飼料和野生獼猴桃飼料。

1.2.4 標本的采集、制備和檢測

禁食12 h后稱重，用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg(4 mL/kg)麻醉大鼠，腹主動脈采血，將取得的血液室溫下靜置40 min，3000 r/min離心10 min，取上清液待測。迅速取部分肝腦組織，分別用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋并切片，HE染色，普通光學顯微鏡下觀察。取部分腦組織精確稱量后加入生理鹽水制成10%的腦勻漿，3000 r/min離心10 min后取上清液待測。按試劑盒說明書測定血清ALT、AST、TG、TC、LPO和腦勻漿TP、SOD、MDA。

1.3 數據處理

用Excle 2003錄入并整理實驗數據，SPSS 22.0統計軟件進行分析。資料采用進行統計描述，單因素方差分析進行統計推斷，LSD法進行兩兩比較。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 行為學表現和病理組織學改變

正常組被毛光滑，活躍，對外界刺激反應靈敏，食欲佳，體重穩定增長，灌胃時反抗少。模型組在灌胃白酒后，隨著灌胃天數增加，出現毛發無光澤、反應遲鈍、精神萎靡、飲食減少，體重下降、嗜睡，甚至出現翻正反射消失，約0.5～1.5 h后恢復正常，灌胃時掙扎反抗劇烈，有不明原因的摔倒。Vc組、獼猴桃組大鼠精神、食欲及活動狀態介于正常組與模型組之間。光鏡下可見，正常組大鼠肝小葉結構完整，形態清晰，肝細胞索排列整齊，呈放射狀，肝竇正常，肝細胞結構完整；腦組織結構正常，神經細胞胞核清晰，胞質豐富，間質無水腫。模型組大鼠肝小葉界限不清，肝索及肝血竇排列紊亂，肝竇變窄，肝細胞體積增大，明顯腫脹，胞質疏松、淡染，核濃縮，出現少量彌漫性大小不等的脂肪空泡。腦組織部分神經細胞排列紊亂，間質可見不同程度水腫，部分神經元體積變小，核固縮成三角形或不規則形，核深染。Vc組、獼猴桃組病理組織學改變與模型組尚未能觀察到差異。行為學表現和病理組織學改變說明大鼠酒精性肝腦損傷模型基本構建成功。

2.2 維生素 C與野生獼猴桃對酒精性肝腦損傷大鼠ALT、AST的影響

表1 各組大鼠血清ALT、AST活性（±s，n=10）Table 1 Activities of ALT and AST in rat serum in each group(±s, n=10)

表1 各組大鼠血清ALT、AST活性（±s，n=10）Table 1 Activities of ALT and AST in rat serum in each group(±s, n=10)

注：*表示與正常組比較，p＜0.001；#表示與模型組比較，p＜0.01；▲表示與Vc組比較，p＜0.05。以下同上。

組別 ALT/(U/L) AST/(U/L)正常組 13.36±1.41 81.23±13.17模型組 32.34±2.87* 152.61±21.85*Vc組 23.65±2.29*# 141.19±19.09*獼猴桃組 19.27±1.74*#▲ 122.82± 8.81*#▲

ALT、AST是檢驗肝臟損傷的一個重要指標，ALT一般主要存在于細胞漿中，而AST則主要存在于細胞質與線粒體中，AST的釋放通常被認為是相對嚴重的肝損傷，因為其可能也暗示著線粒體的損傷，而ALT的釋放通常與急性肝細胞受損有關，因此通過檢測血清ALT、AST的含量，可反映肝細胞受損情況[9]。由表1可見，與正常組相比，模型血清ALT、AST均顯著升高（p＜0.001），說明造模引起大鼠肝臟細胞損傷。與模型組相比，Vc組AST降低，但差異無統計學意義（p＞0.05），ALT 顯著降低（p＜0.05），獼猴桃組ALT、AST均顯著降低（p＜0.01）；與Vc組相比，獼猴桃組ALT、AST均顯著降低（p＜0.05），說明維生素C和野生獼猴桃可減輕酒精造成的肝細胞損傷，且野生獼猴桃作用更明顯。

2.3 維生素 C與野生獼猴桃對酒精性肝腦損傷大鼠TG、TC、LPO的影響

表2 各組大鼠血清TG、TC、LPO水平含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TG, TC and LPO in rat serum in each group (±s, n=10)

表2 各組大鼠血清TG、TC、LPO水平含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TG, TC and LPO in rat serum in each group (±s, n=10)

組別 TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) LPO/(μmlo/L)正常組 0.35±0.03 1.28±0.09 1.84±0.63模型組 0.78±0.05* 1.93±0.13* 7.52±0.95*Vc組 0.58±0.05*# 1.75±0.13*# 4.92±0.70*#獼猴桃組 0.53±0.06*#▲ 1.59±0.11*#▲ 4.17±4.19*#▲

酒精可致血脂代謝紊亂，致使肝臟內TG代謝障礙，肝臟對TC合成能力減弱，使血清中TC、TG含量增高[10]。酒精的攝入能夠誘發肝臟內微粒體中CYP2E1的高度表達，CYP2E1的高表達能夠產生高濃度的氧自由基，氧自由基具有強氧化能力，會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，并產生脂質過氧化產物（LPO），破壞生物膜正常結構和功能，最終造成細胞損傷[11]。

由表2可見，與正常組相比，模型組血清TG、TC、LPO均顯著升高（p＜0.001），說明造模引起大鼠肝臟脂質代謝紊亂，出現脂質過氧化；與模型組相比，Vc組和獼猴桃組TG、TC、LPO均顯著降低（p＜0.01）；與Vc組相比，獼猴桃組TG、TC、LPO均顯著降低（p＜0.05）。實驗顯示，Vc組、獼猴桃組可降低肝細胞TC、TG、LPO含量，減少肝細胞內脂質積累，抑制脂質過氧化程度，阻止肝臟脂肪變性，從而對酒精引起肝損傷發揮預防性保護作用。由于獼猴桃組降低TG、TC、LPO程度優于Vc組，因此野生獼猴桃預防性保護效果優于Vc組。

2.4 維生素C與野生獼猴桃對酒精性肝腦損傷大鼠血清及腦勻漿SOD、MDA的影響

表3 各組大鼠血清及腦勻漿SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 3 Activity of SOD and content of MDA in serum and brain homogenate of rats in each group (±s, n=10)

表3 各組大鼠血清及腦勻漿SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 3 Activity of SOD and content of MDA in serum and brain homogenate of rats in each group (±s, n=10)

組別 血清 腦勻漿SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mL) SOD/(U/mg prot) MDA/(nmol/mg prot)正常組 187.32±10.39 3.70±0.47 679.24±38.31 3.06±0.28模型組 130.07± 6.20* 7.60±0.62* 433.60±24.68* 6.35±0.48*Vc組 150.44± 8.10*# 5.90±0.38*# 494.23±24.68*# 4.45±0.26*#獼猴桃組 152.82± 6.94*#▲ 5.48±0.42*#▲ 525.44±37.36*#▲ 4.08±0.26*#▲

氧化應激是酒精性肝腦損傷最重要的發病機制之一，其中氧自由基對于酒精性肝腦疾病的發生有著重要作用。SOD可通過歧化作用清除體內氧自由基，減少脂質過氧化反應，維持生物膜的正常結構和功能，其水平高低反映機體抗氧化能力的強弱[12]。MDA是脂質過氧化反應的終產物，通過測定其含量可間接推斷自由基對機體的損傷程度[13]。由表3可見，與正常組相比，模型組血清和腦勻漿SOD均降低，MDA均升高（p＜0.001）；說明酒精灌胃已造成大鼠肝臟和腦組織氧化損傷，脂質過氧化產物增多。與模型組相比，Vc組和獼猴桃組血清和腦勻漿SOD升高，MDA降低（p＜0.01）；與Vc組相比，獼猴桃組血清和腦勻漿SOD升高，MDA降低（p＜0.05），表明維生素C和野生獼猴桃可通過增加SOD，降低MDA，來抑制氧化應激反應而減輕酒精對大鼠肝腦的損傷作用。由于獼猴桃組增加SOD，降低MDA程度高于Vc組，因此野生獼猴桃效果優于Vc組。

3 結論

3.1 獼猴桃營養成分冠于各種水果之上，含有20種氨基酸、黃酮類化合物、維生素、膳食纖維以及鈣、鎂、硒、磷、鉀等礦質。許多研究表明獼猴桃是一種促進健康的食物，通常將其對人體健康的積極作用與抗氧化化合物(如：維生素 C、黃酮類化合物)的高含量聯系起來，尤其是維生素C[6,14]。多數野生獼猴桃保健功效的文獻是通過營養成分推測其應有的保健功效，這種推測往往忽略了野生獼猴桃的多種營養物質的聯合作用。實驗先測定野生獼猴桃中維生素C的含量，再按照野生獼猴桃飼料維生素C的含量在飼料中添加維生素C。因此，實驗實質是野生獼猴桃所含多種成分的聯合作用與維生素C單獨作用的比較。

3.2 研究采用2周梯度濃度酒精灌胃模擬亞急性高劑量飲酒狀態復制損傷模型。不少實驗表明，急性酒精性肝損傷模型以肝及血中的某些化學指標改變為主要特征[8,12]，慢性酒精性肝損傷則以肝臟組織結構病變

為主要特征[8]，而腦損傷則有行為學、病理學、血液生化學、影像學、腦電圖、腦地形圖的改變[15]。實驗觀察到，與正常組相比，模型組大鼠行為學有明顯差異，肝腦病理組織學有明顯損傷性病變。血清ALT、AST、TG、TC、LPO顯著升高（p＜0.001），血清及腦勻漿SOD顯著降低，MDA顯著升高（p＜0.001），行為學、病理學、血液生化指標表明2周梯度濃度酒精灌胃建立大鼠酒精性肝腦損傷模型是成功的。

3.3 實驗發現，與模型組比較，Vc組和獼猴桃組血清ALT、AST、TG、TC、LPO降低，血清及腦勻漿SOD升高，MDA降低（p＜0.01）；與Vc組相比，獼猴桃組大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LPO降低，血清及腦勻漿SOD升高，MDA降低（p＜0.05）。表明野生獼猴桃和維生素C均能減輕酒精對肝腦細胞造成的損傷。而野生獼猴桃中所含黃酮類化合物具有抑制自由基的生成、降低脂質過氧化和刺激抗氧化酶的作用，Ca具有抗炎、消腫、抗組織胺作用，Se具有增強機體細胞免疫和體液免疫、延緩衰老、抗腫瘤、保護肝細胞不受肝毒損害的功能[16]，各成分之間是如何起作用如協同、疊加或雙向調節等都有待深入研究。實驗證實，野生獼猴桃組保護酒精所致肝腦細胞損傷的效果優于維生素C組，其機制與野生獼猴桃中維生素C與獼猴桃其他多種成分的聯合作用大于維生素C的單獨作用，從而提高機體抗氧化能力，抑制脂質過氧化，增強機體對自由基的防御能力有關。

3.4 綜上所述，單純維生素C和野生獼猴桃均能明顯減輕大鼠酒精性肝腦損傷，抑制酒精性肝腦損傷的發展，具有預防性保護作用，且野生獼猴桃的多種成分的聯合作用效果優于單純維生素C。因此，在酒精性肝腦損傷防治中食用野生獼猴桃優于服用維生素C制劑，也說明營養素制劑決不能代替新鮮水果。野生獼猴桃生長在純野生的環境中，不使用膨大劑、化肥、農藥，是真正純天然綠色的水果，作為“藥食同源”天然食品具有巨大的潛在利用價值，是一種值得開發利用的野生植物資源。

[1]張楊,楊艷,劉青青,等.我國野生獼猴桃開發應用現狀與存在的問題[J].食品研究與開發,2017,38(15):216-218 ZHANG Yang, YANG Yan, LIU Qing-qing, et al. The present situation and problems of the development and application of wild kiwifruit in China [J]. Food Research and Development,2017, 38(15): 216-218

[2]Hines IN, Wheeler MD. Recent advances in alcoholic liver disease: Role of the innate immune response in alcoholic hepatitis [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004,287(2): 310-314

[3]王丹,王永強,宋楊,等.納洛酮對酒精所致小鼠急性腦損傷和肝損傷的保護作用[J].藥物分析雜志,2014, 34(12):2119-2123 WANG Dan, WANG Yong-qiang, SONG Yang, et al. The protective effect of naloxone against acute brain and liver injury induced by alcohol in mice [J]. Chin. J Pharm. Anal.,2014, 34(12): 2119-2123

[4]趙金梅,高貴田,薛敏,等.不同品種獼猴桃果實的品質及抗氧化活性[J].食品科學,2014,35(9):118-122 ZHAO Jin-mei, GAO Gui-tian, XUE Min, et al. Fruit quality and antioxidant activity of different kiwifruit varieties [J].Food Science, 2014, 35(9): 118-122

[5]Ciacci C, Russo I, Bucci C, et al. The kiwi fruit peptide kissper displays anti-inflammatory and anti-oxidant effects inin-vitroandex-vivohuman intestinal models [J]. Clin Exp Immunol, 2014, 175(3): 476-484

[6]張燕.獼猴桃濃縮物抗氧化能力及免疫調節作用的實驗研究[D].青島:青島大學,2003 ZHANG Yan. The trial study on antioxidant and immune activities of kiwifruit concentration supplementation in animals [D]. Qingdao: Qingdao University, 2003

[7]張宇,魏廣寬,劉英.厄貝沙坦對急性酒精性腦損傷大鼠血清和腦組織中神經元特異性烯醇化酶水平的影響[J].中國校醫,2012,26(5):376-377 ZHANG Yu, WEI Guang-kuan, LIU Ying. Effect of irbesartan on changes of contents of neuron specific enolase in sera and brain tissues of rats with alcoholism brain damage[J]. Chin. J School Doctor, 2012, 26(5): 376-377

[8]曾明,王金萍,丁媛媛,等.可舒膠囊對酒精性肝損傷大鼠血清 NF-κB 和 TNF-α的影響[J].東南國防醫藥,2013,15(1):21- 23 ZENG Ming, WANG Jin-ping, DING Yuan-yuan, et al.Effects of keshu capsule on serum level of NF-κB and TNF-αin rats with alcohol-induced hepatic injury [J]. Military Medical Journal of Southeast China, 2013, 15(1): 21-23

[9]李曉宇,李晶,王一博,等.人參皂苷對酒精性肝損傷的保護作用研究[J].藥物評價研究,2015,38(5):512-515 LI Xiao-yu, LI Jin, WANG Yi-bo, et al. Protection of ginsenosides extract on alcoholic-induced hepatic injury of mice [J]. Drug Evaluation Research, 2015, 38(5): 512-515

[10]DU Guorong, LI Mingjun, MA Fengwang. Antioxidant capacity and the relationship with polyphenol and vitamin C in actinidia fgruits [J]. Food Chemistry, 2009, 113(2):557-562

[11]Lu Y, Cederbaum AI. CYP2E1 and oxidative liver injury by alcohol [J]. Free Radical Biology & Medicine, 2007, 44(5):723-738

[12]羅丹,江玉.三七脂肝丸治療非酒精性脂肪肝肝功能異常59例[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(5):202-205 LUO Dan, JIANG Yu. Sanqi Zhigan pill treat mon-alcoholic fatty liver disease of abnormal liver function patients 59 cases[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2014, 20(5): 202-205

[13]王筱婧,林煥冰,祝倩,等.白藜蘆醇對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].免疫學雜志,2015,31(11):954-958 WANG Xiao-jing, LIN Huan-bing, ZHU Qian, et al.Protective effects of resveratrol on alcohol-induced acute hepatic injury in rats [J]. Immunological Journal, 2015,31(11): 954-958

[14]孫丕健.維生素C對大鼠酒精性腦和肝損傷的保護作用研究[D].蘇州:蘇州大學,2011 SUN Pi-jian. Protective effects of vitamin C on alcoholic brain and liver damages in rats [D]. Suzhou: Suzhou University, 2011

[15]劉春紅,吳鑑明.酒精對大鼠腦組織損傷的研究進展[J].中國醫學創新,2011,8(15):195-196 LIU Chun-hong, WU Jian-ming. Research advances of alcohol tissue damage of rats [J]. Medical Innovation of China, 2011, 8(15): 195-196

[16]孫良順,郭瑩,蔡國棟.硒元素與健康[J].江蘇調味副食品,2010,27(3):15-16,29 SUN Liang-shun, GUO Ying, CAI Guo-dong. Selenium and health [J]. Jiangsu Condiment and Subsidiary Food, 2010,27(3): 15-16, 29