白及總酚閃式提取工藝研究及含量測定

彭焱 唐克華

摘要?[目的]優化白及塊莖中總酚的閃式提取工藝，并比較不同樣地人工栽培白及新生莖總酚含量。[方法]在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交試驗優化閃式提取條件，Folin-酚比色法測定總酚含量。[結果]白及總酚閃式提取最佳條件：料液比1∶40、乙醇體積分數55%、提取電壓160 V、提取時間100 s;5個樣地的7份栽培白及新生莖，總酚含量最低的為0.10%，最高的為0.67%。[結論]閃式提取法能滿足白及總酚迅速提取的要求;不同栽培品種的白及新生莖總酚含量差異較大，這對于白及品質評價具有一定的參考價值。

關鍵詞?白及;新生莖;總酚;閃式提取;含量測定

中圖分類號?S567.239;R284.2文獻標識碼 A文章編號?0517-6611（2018）33-0157-04

白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科白及屬多年生草本植物，以其干燥塊莖入藥，藥用歷史悠久，主要藥用于機體的肺、胃、肝等經脈臟腑病癥，如吐血、咯血、外傷出血、燒燙傷、皮膚皸裂等[1]。白及鮮品色白，是傳統的美容藥材，藥效溫和且無不良反應，常作為功能日化產品原料，如白及牙膏，用于咽喉紅腫熱痛、口腔潰爛、牙齦炎等口腔和牙科疾病的輔助治療[2]。白及目前在保健、美容日化等方面的應用越來越廣泛[3]。研究表明，白及含有黏膠質（白及多糖）、淀粉、聯芐類、菲類及其衍生物、花色素苷類、黃酮類、多酚類、氨基酸及少量的揮發油等生物活性物質[4]，具有抗胃潰瘍、抗氧化、抗菌抗炎、調節免疫力、抗腫瘤等[5-6]生理作用。植物酚類化合物主要分為類黃酮、酚酸和單寧三類。常見的植物酚酸有綠原酸（chlorogenic acid）、原兒茶酸（protocatechuic acid）、沒食子酸（gallic acid）和咖啡酸（caffeic acid）等，植物酚酸有較強的抗氧化、抗菌、抗腫瘤活性，被廣泛應用于保健食品、化妝品等[7]。楊毅等[8]從白及塊莖中分離得到4種多酚類物質，可見白及中含有多種多酚類物質，如能作為新的植物多酚資源開發，這對白及的深加工有重要意義。植物中酚酸種類及含量受多因素影響，如植物成熟期、種植方式及加工條件等[9]。閃式提取器是根據組織破碎原理而設計的一種新型提取器，具有室溫提取、無成分破壞、操作簡單快速、高效節能等優點[10]，現已廣泛應用于植物成分的提取。目前，關于白及總酚提取測定的研究報道還較少，筆者以白及干粉為原料，研究其總酚的閃式提取工藝，并對采自武陵山區5個樣地的7份栽培白及新生莖部位的總酚含量進行了提取和測定。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?儀器。

閃式提取器（型號JHBE-20A，河南智晶生物科技發展有限公司）;高速多功能粉碎機（型號150T，永康市鉑歐五金制品有限公司）;電子分析天平（型號AL204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;紫外分光光度計（型號Evolution 220型，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;臺式低速離心機（型號TDL-40B，上海安亭科學儀器廠）;臺式高速冷凍離心機（型號TGL20M，湖南凱達科學儀器有限公司）;數顯恒溫水浴鍋（型號HH-S4，江蘇金城國勝試驗儀器廠）;紅外水分快速測定儀（型號HB43-S，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;數顯鼓風干燥箱（型號GZX-9146 MBE，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

1.1.2?試劑。無水乙醇、95%乙醇（AR），天津市北辰方正試劑廠;甲醇（AR），天津市大茂化學試劑廠;鹽酸（AR），株洲市星空化玻有限責任公司;Folin酚（AR，C=1.00 mol/L），上海金穗生物科技有限公司;無水碳酸鈉（AR），天津市大茂化學試劑廠;沒食子酸標準品（純度>99%），張家界久瑞生物科技有限公司。

1.1.3?試材。2017年10月，在武陵山區的湖南省洪江市、桑植縣、慈利縣、武陵源區和湖北省鶴峰縣等地，采集栽培3年的白及樣本共8份，每個樣地隨機采集長勢比較接近的帶土白及3株，樣本經吉首大學唐克華教授鑒定為蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]。收集樣株各自所帶泥土、干燥留樣備測，植株體用自來水沖洗、洗凈根莖附著的泥土，晾干表面水分后剪掉樣株的須根、包莖葉，將不同生長年限部位精確分離并稱量、分類標記，再置于烘箱65 ℃下干燥以便長期貯存，干燥好的樣本使用高速多功能粉碎機粉碎并過30目篩，封裝標記、保存備用。各樣本的產地信息及干燥水分含量見表1。

1.2?試驗方法

1.2.1?總酚測定方法。采用Folin-酚比色法，參考文獻中的方法并略作修改[11]。精密稱取沒食子酸標準品10.00 mg，加無水乙醇定容至10 mL，得1.00 mg/mL沒食子酸標準品溶液，于4 ℃冰箱保存，臨用時先以無水乙醇稀釋10倍，然后再取稀釋樣液1.0 mL用蒸餾水稀釋8倍。取稀釋好的沒食子酸標準品溶液0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL于10 mL容量瓶中，加入1.00 mol/L的Folin-酚0.5 mL，黑暗條件下放置10 min，再加入1.00 mol/L無水碳酸鈉溶液2.0 mL，充分混勻，50 ℃水浴處理10 min，冷卻至室溫，在770 nm處測定吸光度。以所測樣液中的沒食子酸質量X（mg）為橫坐標、樣液吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=28.606X+0.101 7（R2=0.999 1，線性范圍0.005 0～0.017 5 mg）。根據吸光度和標準曲線方程計算樣品總酚含量。

1.2.2?單因素試驗。以乙醇-水溶液作為提取劑，準確稱取經粉碎過30目篩的白及樣本（編號SZ）干粉3份。在預試驗基礎上，以提取時間、乙醇體積分數、提取電壓、料液比4個因素的水平值為研究對象。在提取料液比1∶30（g∶mL）、體積分數35%乙醇、提取電壓50 V進行閃式提取，分別提取30、60、90、120、150 s，考察提取時間對提取液中總酚得率的影響。在提取料液比1∶30、提取電壓50 V、提取時間30 s進行閃式提取，乙醇體積分數分別為35%、50%、65%、80%、95%，考察乙醇體積分數對提取液中總酚得率的影響。在提取料液比1∶30、乙醇體積分數35%、提取時間30 s進行閃式提取，提取電壓分別設定為50、80、110、140、170 V，考察提取電壓對提取液中總酚得率的影響。在提取電壓50 V、乙醇體積分數35%、提取時間30 s進行閃式提取，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70提取，考察提取料液比對提取液中總酚得率的影響。提取液均經4 000 r/min離心5 min，取上清液按“1.2.1”中方法進行檢測。

1.2.3?正交試驗設計。在單因素的基礎上，應用SPSS 20.0軟件，設計4因素3水平的正交優化試驗，以提取液中總酚得率為評價指標，確定閃式提取白及中總酚的最佳條件。正交試驗因素與水平設計見表2。

1.2.4?白及總酚提取方法的比較研究。取經粉碎過30目篩的白及樣本（編號SZ）干粉3份，分別在不同提取方式下進行提取。其中，回流提取[12-13]為：料液比1∶45，乙醇體積分數95%，提取時間1.5 h;閃式提取為：料液比1∶45，乙醇體積分數95%，提取時間100 s;甲醇研磨提取[14]為：無水甲醇，料液比8∶1，研磨至勻漿，黑暗環境下靜置24 h，再經12 000 r/min離心15 min，上清液儲存于4 ℃冰箱，備測。

2?結果與分析

2.1?單因素試驗

2.1.1?提取時間的影響。由圖1可知，在30～120 s，白及提取液中總酚得率隨提取時間延長而增加。提取時間大于120 s 之后，提取液總酚得率下降，推測這可能是提取時間加長導致提取液溫度升高，促使提取液中多酚類物質氧化加快，從而導致總酚得率降低。

2.1.2?乙醇體積分數的影響。由圖2可知，乙醇體積分數在35%～65%時，提取液總酚得率隨乙醇體積分數的升高而升高，當乙醇體積分數達65%以后，提取液的總酚得率開始逐漸降低。分析認為，隨著乙醇體積分數提高，一些醇溶性雜質、親脂性強的成分溶出增加，這些物質成分影響多酚類化合物從原料顆粒中的溶出，從而導致提取液總酚得率降低。

2.1.3?提取電壓的影響。由圖3可知，提取電壓在50～140 V時，提取液中總酚得率隨提取電壓升高而升高，當提取電壓達140 V后，提取液的總酚得率出現降低趨勢。分析其原因為：電壓控制著閃式提取器的轉速，隨著提取電壓升高，提取器的攪拌轉速越大，提取液溫度急速上升促使多酚類物質加快氧化，樣液中的多酚含量降低。

2.1.4?提取料液比的影響。由圖4可知，提取料液比在1∶30～1∶40時，提取液總酚得率隨著料液比的增大而快速升高，當料液比大于1∶40之后，提取液中總酚得率逐漸降低。推測原因是：顆粒物料在一定的濃度范圍內，隨著提取料液比增大，液體傳質推力呈相應升高，可促進顆粒物料中提取成分的擴散、溶出，促進成分提取率提高;當物料濃度超出最適范圍后，液體傳質推動力反而下降，阻礙了顆粒物料中成分的擴散和溶出，提取率相應地下降。

2.2?正交試驗

由表3中R值可知，因素B（乙醇體積分數）對閃式提取的影響最大，各因素對總酚提取的影響順序為B>C>D>A。但方差分析顯示，提取時間對白及總酚閃式提取的影響不顯著，其他3個因素水平值對白及總酚閃式提取的影響顯著。因此，可得最佳提取因素的組合為B1C3D2，即乙醇體積分數55%、提取電壓160 V、提取料液比1∶40，提取時間原則上選取最短提取時間100 s，以減輕提取時間延長而增加提取的多酚類物質暴露于空氣中被加速氧化的威脅。

準確稱取經粉碎過30目篩的白及樣本（編號SZ）干粉3份，按照最佳提取組合條件進行驗證性試驗，得到提取液總酚的平均含量為1.38%，與優化試驗中含量最高提取組的很接近，說明優化后的最佳提取組合條件穩定性較高。

2.3?白及總酚提取方法的比較研究

將閃式提取法與文獻報道的2種白及總酚提取方法進行比較研究，提取結束后分別測定提取液的白及總酚得率，結果如圖5。由圖5可知，3種方式提取白及總酚的效率不同，差異較大，以閃式提取法的提取率最高，研磨提取法的最低。閃式提取法的提取率較研磨提取法的提高了138.89%，較回流法提取的提高了57.32%。對于白及總酚提取而言，回流提取法溶劑消耗量大、耗時長，持續加熱能耗高，提取率不高;研磨提取法提取量小、提取率較低;閃式提取法提取時間短，而且能夠最大限度保護提取總酚的活性，操作簡便，提取效率高，安全、環保、經濟。

2.4?不同樣地栽培白及新生莖的總酚含量差異?按優化獲得的最佳閃式提取組合條件，提取測定5個樣地的7份栽培白及樣本新生莖的總酚含量，結果如圖6。由圖6可知，5個樣地7份栽培白及樣本，其新生莖的總酚含量高低為MS>YS>NS>ZJ>HJ>HS>TR。其中，HS（湖北狹葉白及）、TR（湖南桑植引種自貴州銅仁白及）的新生莖總酚含量較低，其中TR最低，僅有0.10%;MS（湖北米氏白及）新生莖總酚含量最高，達0.67%。采用SPSS 20.0分析白及樣本總酚含量與樣地海拔（表1）相關性，得r=0.571、0.400<|r|<0.600，該結果反映樣本總酚含量與樣地海拔相關性不顯著。

3?結論

閃式提取器憑借其適用范圍廣，能適用于植物根、莖、葉、花等軟、硬材料的快速提取，目前在中藥材有效成分提取上的應用十分廣泛。試驗中首次運用閃式提取法提取白及總酚，優化得出的最佳提取工藝條件：提取時間100 s、乙醇體積分數55%、提取電壓160 V、提取料液比1∶40，在此條件下白及提取液中總酚得率為1.38%。以該最佳提取組合條件提取測定比較了7份栽培白及樣本新生莖的總酚含量，其最低者為TR（湖南桑植引種自貴州銅仁白及），僅0.10%，最高者是MS（湖北米氏白及），達0.67%。經初步分析表明，白及總酚含量與樣地海拔的相關性不顯著。

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