基因prtP編碼的細胞膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對干酪乳桿菌體內外黏附性的影響

王鶯鶯　王慧敏　李小函　王念念　王珺垚　許慧卿

摘要 [目的]研究基因prtP編碼的細胞膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對干酪乳桿菌體內外 黏附性的影響。[方法]利用熒光標記技術對干酪乳桿菌親本株（L.c）及prtP基因缺失突變株（L.cΔprtP）進行標記，對6～8周齡的BALB/c小鼠進行干預，測定親本株和突變株體內黏附菌體數量的差異，同時測定其在體外對小鼠腸黏液的黏附性。[結果]L.cΔprtP的黏附率總體上較L.c低，黏附能力較L.c弱。說明干酪乳桿菌的黏附性受lactocepin的影響很大。[結論]干酪乳桿菌體內外黏附性與基因prtP編碼的細胞膜絲氨酸蛋白酶lactocepin有關。

關鍵詞 基因prtP；lactocepin；干酪乳桿菌；黏附性

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）18-0130-04

Effect of Membrane Serine Protease Lactocepin Encoding Gene prtP on Adhesion in vivo and in vitro of Lactobacillus casei

WANG Yingying， WANG Huimin， LI Xiaohan et al （School of Tourism and Culinary·Food Science and Engineering， Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225127）

Abstract [Objective] To study the effect of membrane serine protease lactocepin encoding gene prtP on adhesion in vivo and in vitro of Lactobacillus casei.[Method] L. casei parent strains （L.c） and the prtP gene mutant strains （L.cΔprtP） were marked by fluorescence， we experimented with BALB/c mice of 6 to 8 weeks which were used to measure the number of bacteria in each part of the intestinal tract and compare them while analyzed the adhesion of lactobacillus to mice intestinal mucus in vitro. [Result]The adhesion rate of L.c Δ prtP was generally lower than L.c， and the ability of colonize was weaker than L.c. Therefore， lactocepin played an important role in the adhesion of L. casei. [Conclusion]Adhesion in vivo and in vitro of mice by L. casei is related to serine protease encoding gene prtP.

Key words Gene prtP；Lactocepin；Lactobacillus casei；Adhesion

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）是常見于人體胃腸道以及傳統的發酵乳制品中的乳桿菌屬的一種酪乳桿菌群。有報道稱該菌種可以抵御胃液、膽汁等的侵蝕，在腸道中大量存活。大量的文獻顯示，干酪乳桿菌的應用范圍很廣，具有很高的研究價值[1]。

干酪乳桿菌被廣泛研究應用是由于其良好的益生性，能夠增強胃腸道消化系統的生物性功能，有效抑制有害菌在腸內的繁殖，從而改善腸道機能，其益生功能在很大程度上取決于該菌在胃腸道的黏附特性，其黏附機制是乳酸菌類細胞表面的磷脂壁酸、多糖、完整肽聚糖以及表層蛋白等物質對腸道進行作用[2]。因此，關于乳酸菌黏附性的研究十分重要，但是國內目前關于干酪乳桿菌的研究和應用尚處于起步階段，缺乏分子層面的研究。干酪乳桿菌親本株及突變株的功能、作用機理以及應用相關的課題研究領域具有非常廣泛的發展空間[3]。

該研究從基因層面深入研究干酪乳桿菌生物學特性，為干酪乳桿菌L.c親本株及其lactocepin缺失的突變株L.c△prtP創造了體內和體外2種環境，體內實驗的對象是BALB/c小鼠（6～8周齡），通過進行動物實驗利用熒光標記法觀察親本株和突變株在體內的黏附率變化，體外模型采用的是小鼠原代的小腸黏液，并通過建立標準曲線來計算乳酸菌黏附率，目的是通過比較親本株與突變株在體內外的黏附率，明確干酪乳桿菌體內外黏附性受lactocepin的影響，進一步闡明其對腸道的益生作用，從而為實際應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。干酪乳桿菌Lactobacillus casei（L.c），干酪乳桿菌prtP敲除突變株（L.c△prtP）由揚州大學旅游烹飪·食品科學與工程學院實驗室保存。

1.1.2 培養基及主要試劑。MRS肉湯培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；cFDA-SE（碧云天生物技術研究所）；結晶紫（天津市致遠化學試劑有限公司）；甲醛[中國恒利試劑廠（上海）]；檸檬酸（天津市北辰方正試劑廠）；十二水磷酸氫二鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；二水磷酸二氫鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.1.3 實驗動物。6～8周齡的BALB/c小鼠，45只，購于揚州大學動物醫學中心。

1.2 方法

1.2.1 體內黏附實驗。

1.2.1.1 L.c及L.c△prtP的熒光標記。將5.0 mg cFDA-SE溶解在8.969 mL的DMSO試劑中，用0.22 μm膜過濾除菌，在-20 ℃條件下儲存備用。在MRS肉湯培養基中接入L.c及L.c△prtP，接種量為1%（V/V），在培養箱內37 ℃、5%CO2培育18 h，3 000 r/min下離心5 min，棄去上清，收集菌體沉淀。用無菌PBS漂洗沉淀3次后，重懸于PBS中，并調節濃度至1×109 CFU/mL。向乳酸菌懸液中加入1 mmol/L的cFSA-SE貯存液，至濃度為20 μmol/L，避光37 ℃靜置20 min，4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，用PBS洗滌3次，以去除多余的熒光染料。將菌體重懸于PBS溶液中，加入0.75%甲醛固定液，用流式細胞儀在488 nm的激發波長下檢測cFSA-SE標記率。

1.2.1.2 動物實驗。將6～8周齡的BALB/c小鼠隨機分為3組，每組15只。第1組作為對照組，用200 μL活的未標記的乳酸菌（1×108 CFU/mL）灌胃；第2組用200 μL cFDA-SE標記的活的L.c（1×108 CFU/mL）灌胃；第3組用200 μL cFDA-SE標記的活的L.c△prtP（1×108 CFU/mL）灌胃。灌胃后3組小鼠均正常飲水喂食，在灌胃后的第1、2、4、6和7天脫頸處死小鼠，在無菌環境下取小鼠的十二指腸、空腸、回腸和結腸各2 cm，縱向剪開，清除腸道附著物，用500 μL無菌PBS溶液反復沖洗，用400目銅網過濾，然后用甲醛固定液（0.75%）固定，避光保存，用流式細胞儀于488 nm激發波長下進行檢測，分析確定L.c及L.c△prtP在小鼠腸道各部位的黏附情況，按如下公式計算黏附率（公式中的2 cm表示腸段長度）：

黏附率（CFU/cm）= 陽性乳桿菌總數 2 cm

1.2.2 體外腸黏液黏附實驗。

1.2.2.1 腸黏液制備。參考文獻[4]脫頸處死6～8周齡的BALB/c小鼠，解剖取出小腸放在冰面上，用pH 7.2、0.01 mol/L無菌PBS反復沖洗3～5次，縱向剪開腸壁，用無菌載玻片刮取小腸內表皮黏液，與2倍體積pH 7.2、0.01 mol/L的PBS混勻，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，用考馬斯亮藍法測定黏液蛋白的濃度，分裝后在-20 ℃條件下保存備用。該試驗參照Vesterlund等[5]建立的方法，稍作修改。

1.2.2.2 菌株的黏附。取96孔板加入小鼠小腸黏液提取液（2.0 mg/mL），每孔100 μL，4 ℃條件下過夜固定，去除未固定的提取液。 L.c和L.c△prtP懸液（pH4.0）各加4個平行孔，每孔100 μL，4 ℃培育2 h，用250 μL PBS（pH4.0）反復洗滌3～4次，以去除未黏附的乳酸菌。將96孔板置于烘箱60 ℃、30 min，每孔各加100 μL 0.1%結晶紫染色，50 min后用250 μL PBS（pH4.0）洗滌5次，然后加入100 μL 0.02 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.3）重懸，室溫下放置60 min，測定600 nm處的吸光值（OD600）。

1.2.2.3 建立標準曲線。取10 mL不同濃度的乳酸菌PBS菌懸液于10 mL離心管中，每個濃度取3組平行，8 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL 0.1%結晶紫染色50 min，收集菌體，PBS（pH4.0）洗滌5次，加入1 mL 0.02 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH4.3）重懸，室溫放置60 min，并測定600 nm處的吸光值，確定OD600和乳酸菌細胞數的關系，建立曲線。

1.2.2.4 數據計算。計算96孔板上黏附的乳酸菌數量，用黏附的乳酸菌數和加入的乳酸菌的比值來代表菌株的黏附能力。

1.2.3 數據處理。數據均以平均值±標準差表示，使用SPSS16.0軟件進行分析。P<0.05即結果具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 L.c及L.c△prtP在小鼠腸道各部位的黏附情況

2.1.1 L.c 和L.c△prtP在小鼠不同腸段中的黏附情況。用cFDA-SE標記的L.c 和 L.c△prtP灌胃小鼠，分別在灌胃后的第1、2、4、6和7天處死，用流式細胞儀檢測小鼠十二指腸、空腸、回腸和結腸中L.c 和 L.c△prtP的黏附情況。

2.1.2 流式細胞儀檢測小鼠不同腸段中L.c和L.c△prtP的黏附情況。

從圖2可以直觀地看出L.c在各腸段的黏附率普遍高于L.c△prtP，與該研究提出的假設一致。

2.2 L.c及L.c△prtP對小鼠腸黏液的黏附

2.2.1 標準曲線。根據相關參考文獻[6]，使用濃度為2.0 mg/mL的黏液蛋白，pH為4的磷酸緩沖液。若濃度低于2.0 mg/mL，則蛋白無法鋪滿細胞板，乳酸菌不能進行有效黏附；若濃度高于2.0 mg/mL，則蛋白過多堆疊，乳酸菌無法與下層蛋白進行有效黏附，在洗滌時隨表層蛋白一同被去除。緩沖液pH過大或過小都會造成黏附量降低，pH為4時兩株菌黏附量都相對較大。

研究確定了OD600和乳酸菌細胞數的關系，并建立了曲線，當細菌濃度為1×108～1×109 CFU/mL時，L.c細菌濃度（x）與測得OD600（y）的線性關系為y=0.099 8x-0.086 8，R2=0.996 4（圖3A）；當細菌濃度為1×108～1×109 CFU/mL時，L.c△prtP細菌濃度（x）與測得OD600（y）的線性關系為y=0.112 3x-0.064 8，R2=0.993 1（圖3B）。通過該方程計算96孔板上黏附的乳酸菌數量，用黏附的乳酸菌數和加入的乳酸菌數的比值來體現菌株的黏附能力。

2.2.2 乳酸菌對小鼠小腸黏液的黏附。

通過建立的線性關系計算得出干酪乳桿菌L.c和L.c△prtP對小鼠腸黏液的體外黏附能力。L.c的黏附率為4.638%，L.c△prtP的黏附率為3.665%，黏附能力存在顯著差異，L.c黏附能力高于L.c△prtP（P<0.05）。

3 討論

對于干酪乳桿菌的研究包括體內和體外兩個方面，對小鼠小腸黏液建立測定干酪乳桿菌L.c親本株以及乳桿菌的lactocepin缺失突變株L.c△prtP黏附能力的體外模型，同時采用熒光標記法觀察兩株菌在小鼠體內的黏附情況，得出親本株與突變株在體內外黏附性的差異，明確lactocepin是否缺失對干酪乳桿菌體內外黏附性的影響[6]。

試驗結果得到在體外L.c小鼠腸黏液的黏附率為4.638%，L.c△prtP小鼠腸黏液的黏附率為3.665%，L.c△prtP的黏附性明顯低于L.c，這表明干酪乳桿菌小鼠腸黏液黏附性受基因prtP編碼的絲氨酸蛋白酶lactocepin的影響較大。在體內黏附實驗中，干酪乳桿菌及其突變株在小鼠的十二指腸、空腸、回腸、結腸中的黏附量呈現較大的差異。除小鼠結腸外，在小鼠的空腸、回腸以及十二指腸中，L.c的黏附量整體高于L.c△prtP。但是在空腸和十二指腸中，L.c的黏附量隨著時間的增長均有不同程度的下降，且發現回腸中總黏附菌量相較于小腸其他部位要高很多，這說明干酪乳桿菌在腸道內主要黏附部位是回腸。由于干酪乳桿菌在體內的黏附受到多重因素的影響，對于同一菌株而言不同的黏附對象還會表現出宿主的特異性，暫時無法得知干酪乳桿菌在小鼠腸道不同部位黏附率產生差異的原因。但可得出的結論是乳酸菌對腸黏液以及小鼠腸道細胞的黏附是受prtP基因編碼的細胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin的影響介導的，但具體的黏附機制以及是否會受到其他因素作用需進一步研究。

干酪乳桿菌可以在腸道內大量存活， 起到調節腸內菌群平衡、改善人體腸道的消化吸收功能、緩解乳糖不耐癥以及過敏等益生保健作用[7-8]，因此要積極利用現有的科學資源充分發揮出益生菌對于機體的保健功能，研發出安全有效的益生菌微生態制劑或其菌體相關產物的免疫調節劑，為促進生命科學的發展做貢獻。

參考文獻

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[4] 李娟，張耀庭，曾偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，13（2）：118-120.

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