垂葉榕癭花發育特性的初步研究

賈效成　陳良秋

摘 要 研究榕屬植物癭花發育特性是理解榕樹/榕小蜂協同進化內在機制的重要內容。本文解析了垂葉榕隱頭花序伴隨癭花發育的5個發育時期，采用同工酶電泳的方法比較了癭花與正常雌花同工酶（包括過氧化物酶、過氧化氫酶、淀粉酶和酯酶）譜帶的差異，采用掃描電鏡對比了癭花壁與授粉后雌花子房壁的差異。結果表明，癭花被榕小蜂產卵以后，至少啟動了一個與消除過氧化物有關的酶；而且，癭花子房壁結構疏松，內含物小而少，雌花子房壁結構致密且內含物多而大，說明癭花發育所消耗的營養物質大于正常雌花發育的消耗。研究結果支持造癭生物匯集營養與植物防御行為的互利假說。

關鍵詞 垂葉榕；癭花；同工酶；協同進化；假說

中圖分類號 Q941 文獻標識碼 A

Abstract Fig trees （Ficus spp.； Moraceae） are pollinated by species-specific fig wasps （Agaoninae） and have long been held as the example system of co-evolution. In Ficus benjamina， five development phases of syconia are analyzed. We hope to explore the differences between female flowers and gall flowers. The development of gall flowers is the important key to understand the internal mechanism of fig/fig wasp co-evolution. Using an isozyme electrophoresis and scanning electron microscope， in female flowers and gall flowers， we compared the isozyme （including Amy， Pox， CAT and Est） zymogram. The structure differences in the ovary wall of female flowers and gall flowers were also compared. The result showed that a kind of Pox was activated at least when gall flowers was formed. Moreover， the structure of the ovary wall was loose， the inclusions were small and less； the ovary wall structure of the female flowers was dense， and the inclusions were large and more， indicating that there was more nutrition consumption in the development of gall flowers than that in the seed flowers. Based on these results， we hereby support the mutual benefit hypothesis in the gall-insect mutualism.

Keywords Ficus benjamina； gall flower； isozyme electrophoresis； co-evolution； hypothesis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.006

?？崎艑僦参铮‵icus spp.）廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區。榕屬植物具有特化的隱頭花序（syconium），通常稱為榕果或隱頭果。隱頭花序頂端由小孔苞片所形成孔道，只在特定時期讓專一性的榕小蜂（fig wasp）進入授粉或提供部分雌花子房供小蜂產卵形成蟲癭，延續小蜂種群[1-3]。為維持這種互利關系，榕屬植物及榕小蜂在形態及結構上高度特化，形成專一性的共生關系。二者相互依賴，互惠互利，是動植物間關系密切的共生伙伴。榕屬植物與其傳粉昆蟲的這種互利共生關系，是研究植物和昆蟲協同進化的模式系 統[1-3]。榕屬植物可分為雌雄同株與雌雄異株兩大類。雌雄同株的榕果內，雌花一部分被昆蟲產卵發育為蟲癭，一部分被傳粉而形成種子。雌雄異株的榕果，則有產生種子的雌榕果以及產生花粉與蟲癭的雄榕果之分。Hartley[4]曾比較了癭組織和鄰近正常組織的元素組成及次生代謝物，發現癭組織具有較低水平的氮化合物和較高水平的酚類化合物。不同造癭者在同一寄主上的造癭組織的化學組成不同，同一種癭瘤的不同發育階段癭組織的化學組成也不同，研究者認為造癭者可能產生了某種專一性的活性物質，促使癭組織的化學組成發生實時性的改變。

關于蟲癭形成的原因和蟲癭與植物的相互關系，許多學者提出不同的假說。Price等[5]將這些假說分成六類，分別是：中性共生（neutralism）的非適應性假說（nonadaptive hypothesis），屬于植物的防御行為的植物防御假說（plant protection hypothesis），造癭生物匯集營養與植物防御行為的互利假說（mutual benefit hypothesis），僅為造癭生物匯集營養的營養假說（nutrition hypothesis），為躲避環境逆境的微環境假說（microenvironment hypothesis），為抵抗和躲避天敵的天敵假說（enemy hypothesis）。這些學說雖然可解釋一種或幾種類型蟲癭的形成，但總有不完善的地方。這些假說也從另一側面反映了自然界蟲癭種類的多樣性和復雜性。國內對榕屬植物與傳粉榕小蜂、非傳粉小蜂之間的相互關系及共生維持機制已經開展大量研究[6-8]，但針對榕屬植物隱頭花序內的癭花發育特性的研究至今報道較少[9-11]。

垂葉榕是我國南方常見的雌雄同株榕屬植物，賈效成等[12]已鑒定其在廣州地區的傳粉小蜂為Eupristina koningsbergeri，3種非傳粉小蜂分別是Epichrysomallinae sycobia sp.、Philotrypesis sp.1和Philotrypesis sp.2。為進一步闡明榕/蜂共生的生理生化過程，探索共生過程中的代謝活動，尋找隱頭花序內榕/蜂共生關系中的蟲癭形成與一般蟲癭形成的異同點，本研究以垂葉榕為研究對象，介紹了垂葉榕隱頭花序發育的5個時期，研究了垂葉榕雌花和癭花發育初期過氧化物酶、過氧化氫酶、淀粉酶和酯酶的譜帶差異，并觀察了二者子房發育過程中子房壁的結構，旨在對榕屬植物的癭花發育特性有新的認識，為進一步揭示榕樹/榕小蜂協同進化的內在機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 以垂葉榕隱頭花序內的雌花

和癭花為研究材料。垂葉榕主要分布在華南地區，為雌雄同株，其專一性的造癭昆蟲是垂葉榕小蜂（Eupristina koningsbergeri），屬膜翅目榕小蜂科（Hymenoptera：Agaonidae），翅膀退化的雄蜂先行羽化，隨即與蟲癭內的雌蜂交配后死亡。雌蜂羽化后，沾附花粉飛離榕果，尋找新的處于雌花期的榕果產卵。進入新榕果的小蜂可以在短花柱雌花上產卵形成蟲癭（癭花），同時在長花柱雌花上傳粉形成種子。在研究隱頭花序發育時取自然條件下各時期的花序，置于體式顯微鏡Olympus（OLYMPUS SZ-CTV）下觀察；在研究癭花與雌花同工酶譜帶時，在雌前期以80目的塑料網袋套住隱頭花序，在雌花期人工放飛傳粉小蜂進入網袋，排除非傳粉小蜂的影響。

1.1.2 樣地和樣株 實驗于2014年8月至2015年10月在中國科學院華南植物園（11318E，2306N）實施。位于廣東省廣州市，海拔20～327 m，年平均氣溫 21.8 ℃， 屬于熱帶亞熱帶氣候。以植物園8株垂葉榕為樣株，觀察取材。

1.2 方法

1.2.1 雌花與癭花的同工酶分析 在間花期取長花柱雌花和癭花為實驗材料，同工酶分析參照王中仁[13]和孫新立等[14]的方法，并略有改進，具體實驗參數見表1。

1.2.2 隱頭花序發育的劃分及拍照 根據Galil等[3]的方法將榕樹隱頭花序的發育周期分為5個時期。該分期標準被諸多學者所引用，具有合理性與權威性，是研究榕屬植物癭花發育公認的尺度。癭花發育的典型特征于體視顯微鏡（OLYMPUS SZ-CTV）下觀察并拍照（Nikon4500）。

1.2.3 癭花與雌花的掃描電鏡觀察 在間花期取長花柱雌花和癭花，用2%戊二醛常溫固定4 h后磷酸緩沖液洗滌2 h（每次20 min，換洗6次），1%鋨酸4 ℃固定12 h，2 h洗滌（每次20 min，換洗6次），再用依次30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精系列脫水，臨界點干燥，樣品用醋酸異戊酯處理30 min，樣品常規方法粘臺，JFC-1100離子濺射鍍金，JSM-T300掃描電鏡觀察，拍照。

2 結果與分析

2.1 隱頭花序的發育

如圖1所示，垂葉榕隱頭花序的發育共分5個時期，分別是：（1）雌前期（pre-female phase），花序芽開始發育并逐漸膨大，直至隱頭花序內的雌花具有授粉能力之前。如圖1-A所示，此時雄花尚未開始發育，短花柱雌花和長花柱雌花均已發育。該發育階段歷時較短，僅有3～5 d。（2）雌花期（female phase），從雌花具有授粉能力開始，至雌花接受花粉受精或被榕小蜂產卵。此時花序口的硬質苞片打開，榕小蜂通過花序口鉆入花序腔進行產卵和傳粉。此時長花柱雌花已經被榕小蜂產卵，短花柱雌花已經授粉，雄花亦開始發育， 如圖1-B所示。（3）間花期（interfloral phase），此時受精或被產卵的雌花子房膨大，開始發育為種子或孕育榕小蜂幼蟲的癭花（gall flower），雄花繼續發育，花序也開始膨大。榕小蜂幼蟲在此期間逐漸發育直到成熟。如圖1-C所示，該發育階段歷時較長，約3周時間。（4）雄花期（male phase），花序膨大并開始變的松軟，苞片萎縮使花序通道打開。雄花發育成熟，花藥開裂散發花粉。雌、雄榕小蜂由癭花內鉆出。如圖1-D所示，該發育階段較短，1～2 d。（5）花后期（postfloral phase），此時癭花內的榕小蜂已經遷飛，種子成熟，雄花凋謝，如圖1-E所示?；ê笃跉v時也較短，2～4 d。

2.2 雌花與癭花的同工酶譜帶比較

由圖2可以看出，4種同工酶僅有過氧化物酶譜帶清晰明顯，另外4種同工酶均不能跑出清楚的譜帶。在過氧化物酶譜帶中，癭花組織明顯缺少一條小分子的譜帶，證明癭花被榕小蜂產卵以后，至少啟動了一個與消除小分子過氧化物有關的酶。

2.3 雌花與癭花的形態結構比較

如圖3-A、B所示，長花柱雌花授粉后子房膨大明顯，柱頭呈羽片狀；癭花的子房被榕小蜂

產卵后膨大較小，花柱短而細，二者區分明顯。圖3-C、D顯示了雌花和癭花的子房壁整體形態，其中雌花的子房壁內含物明顯較多，造成其切面粗糙；而癭花的子房壁內含物較少，其切面光滑，空洞較多。進一步放大可見二者切面差異的細節，如圖3-E、F箭頭所示，雌花子房壁的細胞充滿內含物，使細胞充實飽滿，說明其營養充足；癭花子房壁的細胞內含物少而小，細胞空洞較大，說明其營養消耗較大。

3 討論

3.1 宏轉錄組測序所揭示的基因表達差異

Martinson等[9]以巴拿馬的大葉榕（Ficus obtusifolia）為材料，采用宏轉錄組測序的方法研究了雌花和癭花授粉前后的基因表達差異，發現產卵前的癭花與授粉前的雌花相比，其與黃酮類及碳水化合物代謝相關的基因表達顯著上調；而產卵24 h后的癭花其與查耳酮合成酶和異構酶代謝相關基因表達顯著上調。說明在該種雌雄同株榕樹中，靠近花序腔的雌花與遠離花序腔的雌花在授粉和被產卵前已經發生了功能上的初步分化，二者在雌花期的基因表達差異顯著，使得榕小蜂傾向于產卵在含黃酮類和碳水化合物物質更多的雌花上；產卵后的癭花在卵的刺激下，產生了更多的查耳酮類物質，使得癭花開始形成。本研究在間花期取樣，僅關注了過氧化氫酶、過氧化物酶、酯酶和淀粉酶，此時傳粉小蜂幼蟲和種子已經開始發育，其營養消耗的種類和幅度與上述研究相比已經發生很大變化，如糖類、酯類、黃酮類和查耳酮類物質等。另一方面，受上述研究啟發，在雌花期和間花期初始階段，可以重點分析與碳水化合物代謝、黃酮類代謝和查耳酮代謝相關酶活性的變化，這需要進一步研究。

3.2 雌花與癭花組織的同工酶

植物在逆境條件下正常的氧代謝受阻，體內的活性氧含量會迅速積累，膜脂過氧化作用將導致膜系統受損，引起細胞膜的通透性增加及電解質的滲漏，最終會導致細胞死亡和組織被損壞，使得植物處于一種損傷狀態[15]。汪少妃等[15]在研究刺桐姬小蜂成癭過程時發現，受刺桐姬小蜂危害后受害葉片內保護酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）]活性顯著提高，說明刺桐姬小蜂蟲癭的形成誘導刺桐的保護酶產生，表現出了明顯的防御反應。蟲癭的形成顯著提高了寄主葉片的SOD、CAT、POD、PPO活性；其中SOD、CAT、PPO活性主要體現在蟲癭組織上，開裂期酶活性均達到最大； PPO活性隨蟲癭發育不斷增加，而SOD、CAT活性分別在成熟期、成長分化期都有所下降，POD活性則主要表現在非蟲癭組織上。本研究發現，雌花與癭花組織中4種同工酶僅有過氧化物酶譜帶清晰明顯，另外3種同工酶均不能跑出清楚的譜帶。對于刺桐姬小蜂蟲癭形成的研究發現，在蟲癭的成長分化期其SOD、CAT、POD、PPO活性的測定值分別為200～300、15～20、2 500～4 000、50～80 U/mg prot。由此可推測，在本研究中由于過氧化物酶的含量很高，因此容易跑出清晰的譜帶，而另外一些酶由于含量太少，難以跑出清晰的譜帶。在今后的研究中可以考慮利用比色的方法測定含量少的酶的活性，這有待于進一步研究。

3.3 關于隱頭花序的發育

Galil等[3]將榕樹隱頭花序的發育周期分為5個時期，本文對垂葉榕內部雌花和癭花的發育研究發現，垂葉榕的隱頭花序發育經歷5個明顯的

時期，這與其余榕屬植物花序的發育過程相似[16]?；ㄐ虬l育過程中，雌花、癭花和雄花形態區分明顯，尤其是花柱的長度和花藥，可以作為區分特征。另外研究中還發現，一些非傳粉小蜂（non- pollinating wasp）在雌花的子房內產卵形成的癭花特別大，如圖1-E所示，最右邊的癭花即為非傳粉小蜂寄生形成的癭花，這可能與其幼蟲體型較大，發育過程消耗更多的營養有關。由于非傳粉小蜂的種類特別多[17]，產卵的時間差別很大，產卵的部位多樣，其產卵造成的癭花可能與傳粉小蜂產卵造成的癭花存在很多差異，這需要進一步研究。

3.4 造癭昆蟲對營養的消耗

蟲癭是造癭昆蟲發育的場所，幼蟲主要有兩種方式獲得植物的營養，一種方式是營養截取，即在植物正常營養流向的通路上攔阻養分；另一個方式是營養匯集，即重新改造植物的營養流向，創造新的營養匯集庫，把蟲癭四周的營養匯集起來。Wool等[18]以放射線同位素示蹤的方法進行研究，發現癭綿蚜在黃蓮木屬植物能創造營養匯集庫，且營養匯集的強度與造癭昆蟲的種類及蟲癭的類型均有相關關系。有些蟲癭所匯集的營養從隔壁的芽枝轉運而來，而有些蟲癭營養匯集局限在同枝條的葉片、同葉片的小葉、或僅能獲得同小葉的營養。本文研究的蟲癭存在于隱頭花序中，榕小蜂的幼蟲發育期間引起的營養匯集應主要來源于隱頭花序，其營養是否亦來源于鄰近葉片或鄰近的雌花尚有待于進一步研究。

Jansen-Gonzalez等[19]通過組織切片的方法發現，對于主動傳粉的雌雄同株榕屬植物，其幼蟲發育的前兩個階段寄生于子房，而后期則寄生于膨大的胚乳組織。本文的研究表明，在癭花發育后期，組成癭花的細胞空洞大而內含物少，其營養可能用于蟲癭幼蟲發育。對于非主動傳粉類型及非傳粉小蜂產卵制造的蟲癭，其發育過程影響因素更多，尚需要進一步研究。

汪少妃等[20]研究表面，刺桐姬小蜂蟲癭的結構包括表皮層、保護層、薄壁層和癭室4部分。其中，表皮層由表皮細胞和皮層組織構成，保護層主要由綠色的厚壁細胞以及一些含有液泡的軟組織組成；薄壁層主要由薄壁細胞組成，且內層薄壁細胞解體，為蟲體發育提供營養。蟲癭含有細胞壁薄而營養物質豐富的組織和大量維管組織，這直接影響了營養物質的產生和運輸，使得蟲癭成為一個新營養庫源，可為蟲體生長發育提供營養。本研究通過掃描電鏡發現，在間花期隨著蟲體發育，癭花壁內側存在大量解體破碎的細胞，這些細胞應為釋放營養物質后解體的內層薄壁細胞；這些營養物質的組成和含量變化在癭花的不同發育階段差別很大，可能以碳水化合物、黃酮類、查耳酮類等為主，這需要進一步研究。

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