HPLC-ICP-MS法測定牛肝菌中汞的形態

楊玲春，丁元明，王英，張薇，張銀，殷紅，陳宏仙，李云飛，朱紅玉，陳蕓，陳麗萍

（云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，云南昆明650228）

汞（Hg）是一種對人體健康產生危害的重金屬元素，具有強揮發性、生物富集性和高毒性，普遍存在于大氣、土壤及水體中[1-3]。Hg及其化合物可通過呼吸道、食物鏈和皮膚接觸等多種途徑侵入人體，由于Hg特殊的理化性質，不易排出體外，超出一定限量時可以造成大腦、中樞神經系統、消化系統及肝、腎的損害，嚴重危害人體健康[4-5]；自然界的汞主要以金屬汞、無機汞（Hg2+）和有機汞（MeHg、EtHg、PhHg）的形式存在，其對生物體毒性的大小并不僅僅取決于該元素的總量，而是與該元素的化學形態密切相關，同種元素不同形態之間的毒性及可利用性常存在較大差異。有機汞因具有脂溶性，易被機體所吸收，其毒性遠大于無機汞，尤其是甲基汞對中樞神經系統易造成不可逆的損害[6-7]。因此，有必要建立快速、有效的汞形態分析方法。

牛肝菌（Boletus fungi）是一種珍稀名貴的野生食用菌，富含蛋白質、氨基酸、多糖、維生素及多種礦物質元素，因其味道鮮美，營養豐富，被認為是理想的綠色健康食品，深受國內外消費者喜愛，在國際貿易中牛肝菌是重要的創匯農副產品[8]。多數野生食用菌對重金屬Hg有很強的富集能力，子實體中的重金屬含量與土壤、水分、大氣等生長環境因子具有密切聯系[9]。牛肝菌在生長過程中對Hg、As、Cd、Pb等多種有毒重金屬元素均具有強富集作用，尤其是Hg含量超標問題凸顯，對消費者身體健康和生命安全造成威脅[10]。因此，研究牛肝菌或牛肝菌制品中汞元素的化學形態對正確認識牛肝菌中汞元素對人體的危害具有重要意義。

目前測定汞形態的方法很多[11]。最早的方法為氣相色譜法，上世紀80年代以后，原子發射光譜（atomic emission spectroscopy，AES）、原子熒光光譜（atomic fluorescence spectrometry，AFS）、電感耦合-等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）等元素分析儀器與高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）聯用技術發展的日趨完善，已廣泛應用于材料和生命科學樣品中元素的形態分析[12-14]。其中ICP-MS具有極低的檢出限、較寬的線性范圍、可同時測定多種元素、分析速度快、線性范圍寬、靈敏度高等優點，成為形態分析中首選的檢測方法[15]。本文采用微波萃取并結合高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用技術，建立了快速、準確測定牛肝菌中不同形態汞元素的方法，為全面客觀評價牛肝菌中汞元素的危害提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5個批次的牛肝菌干片均來源于云南省楚雄州南華縣，試驗編碼為S1～S5。

醋酸銨（分析純）、甲醇（色譜純）：默克公司；鹽酸（36.0%～38%，分析純）：西隴科學股份有限公司；L-半胱氨酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基汞標準溶液[（GBW08675，76.6mg/kg（以甲基汞計）]：中國計量科學研究院；乙基汞標準溶液[（GBW（E）081524，75.3mg/kg（以乙基汞計）]：中國計量科學研究院；二價汞離子標準溶液[（GSB04-1729-2004，1 000mg/kg（以 Hg計）]：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；試驗用水：超純水。

1.2 儀器與設備

1200型高效液相色譜儀、8800型三重四級桿電感耦合等離子體質譜儀：美國Agilent科技有限公司；GM300型刀式混合研磨儀：德國Retsch公司；XPE204型電子天平：瑞士Mettler公司；4-start9609BNWP型pH計：美國奧立龍；Milli-Q純水系統：美國Millipore公司；3K15型高速冷凍離心機：德國SIGMA公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）：Agilent Eclipse plus C18色譜柱；進樣量：100μL；柱溫：30℃；流速為1.0mL/min；流動相：A相為甲醇，B相為10mmol/L醋酸銨（含0.12%L-半胱氨酸）并用10%氨水調節pH值至 7.5，A ∶B（8∶92，體積比）混合等度淋洗。

RF入射功率：1 550W；RF匹配電壓1.74 V；同心圓霧化器，載氣為純度≥99.99%的氬氣，等離子體氣體流速：15.0 L/min；載氣流速：0.65 L/min；輔助氣體流速：0.45 L/min；蠕動泵轉速：0.1 r/s；采樣深度：8mm；檢測質量數：m/z=202（Hg）；停留時間為 0.5 s（m/z=202）。

1.3.2 混合標準儲備液的配制

精密吸取二價汞、甲基汞和乙基汞標準溶液用甲醇配成質量濃度為1 000μg/L的混合標準儲備液，置于棕色試劑瓶中，避光保存于4℃冰箱中備用。

1.3.3 樣品前處理方法

稱取研磨儀磨細的牛肝菌樣品0.2 g于萃取用玻璃管中，放入磁性攪拌子，加入10mL萃取液（0.07mol/L的HCl），用微波萃取儀在55℃，壓力15MPa，功率110W，保持15min的條件下進行萃取。萃取完成后放入冰箱中靜置5 min，將上清液轉移至離心管中，14 000 r/min，4℃，5min條件下離心，吸取上清液經0.2μm水相針式濾器過濾。過濾后吸取500μL樣品溶液用流動相1∶1稀釋，混勻，得到待測樣液，同時做空白對照試驗。

1.3.4 標準曲線及線性范圍

將混合標準儲備液用流動相稀釋成濃度為1、10、25、50、100、200μg/L 的系列混合標準使用液（現用現配），進樣量 100μL，以二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）的色譜峰面積與相應濃度分別進行線性回歸分析，得到各自的標準曲線、相關系數和線性范圍。以空白溶液基線信號3倍（即信噪比S/N為3 ∶1）時 Hg2+、MeHg、EtHg 對應的濃度為檢出限。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 精密度試驗

精密吸取“1.3.2”項下制備混合標準儲備液（10μg/L），按照“1.3.1”項下的儀器條件連續重復進樣10次進樣分析，記錄峰面積。

1.3.5.2 重復性試驗

取同一批次樣品平行稱取10份，經過樣品前處理制備待測樣液，按照“1.3.1”項下的試驗條件依次進樣分析，記錄峰面積。

1.3.5.3 穩定性試驗

取同一批次樣品平行稱取1份，經過樣品前處理制備待測樣液，按照“1.3.1”項下的試驗條件，分別于0、2、4、6、8、12、24、48 h 進樣分析，記錄峰面積。

1.3.5.4 加標回收試驗

應用本文建立的方法對已知含有量的牛肝菌樣品進行測定，向牛肝菌提取液中分別添加3個不同濃度水平的二價汞、甲基汞、乙基汞的混合標準溶液，按照“1.3.1”項下的試驗條件同時測定6個平行樣計算加標回收率和相對標準偏差（RSD）。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

分別使用AgilentEclipseplus-C18（150mm×4.6mm，5μm）和Athena C18（250mm×4.6mm，5μm）兩根色譜柱在其它試驗條件不變的情況下分離標準樣品，二價汞（Hg2+）出峰時間分別為1.98min和5.73min并且Athena C18色譜峰明顯展寬，因此選用AgilentEclipse plus-C18（150mm×4.6mm，5μm）做為色譜分析柱。

2.2 色譜流速的選擇

保持儀器其他試驗參數不變的情況下考察了流動相流速分別為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL/min 時，3 種形態汞的分離情況。試驗結果表明隨著流動相流速的增加3種汞形態的保留時間明顯縮短，信號強度明顯增強，但是當流速高于1.0mL/min后，3種汞形態分離度開始下降，故試驗選擇流動相流速為1.0mL/min。

2.3 流動相的選擇

在流動相中加入親水性較強的L-半胱氨酸作為汞形態分析的絡合物，可以明顯縮短檢測時間，同時考慮到L-半胱氨酸濃度太大對色譜柱有損害，因此選擇0.12%L-半胱氨酸作為汞形態分析的絡合劑。

選用質量濃度為8%（體積分數）的甲醇作為有機相有利于ICP-MS分析信號的穩定及消除汞的記憶效應；同時在流動相中加入適量的緩沖鹽醋酸銨，能夠有效改善拖尾現象，試驗結果顯示當醋酸銨含量增加到10mmol/L時，峰形和出峰時間達到最佳。

2.4 洗脫方式的選擇

保持1.0mL/min流速條件下，當流動相中甲醇含量從5%增加至50%時，3種不同形態的汞出峰時間明顯縮短，但各自的分離效果差，無法做到基線分離。因此，通過試驗選擇等度洗脫的方式有效解決了分離度差和洗脫時間長的問題。

2.5 等離子體質譜條件的優化

試驗分別對載氣流速以及采樣深度進行考察，載氣流速影響著霧化效率，對質譜信號的影響明顯。隨著載氣流量的增大，質譜信號也隨之增大，當載氣流速達到0.65 L/min時信號值達到最大，繼續增大載氣流速，質譜響應信號反而減小，因此，試驗采用的載氣流速為0.65 L/min。采樣深度對分離效果的影響不大，但對信號強度有很大影響，在采樣深度為8mm時信號最強，故試驗選擇采樣深度為8mm。

采用上述試驗條件混合標準使用液（10μg/L）中的二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）色譜分離圖見圖1。

圖1 標準溶液中二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）色譜圖（10μg/L）Fig.1 Chromatogram of Hg2+，MeHg and EtHg（10 μg/L）

從圖1可以看出3種形態的汞出峰順序為二價汞、甲基汞、乙基汞，保留時間分別為1.98、2.64、4.47min，在5min之內二價汞、甲基汞、乙基汞實現了基線分離且峰形對稱。

2.6 線性關系考察結果

計算得到二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）的標準曲線回歸方程，試驗結果見表1。

表1 二價汞、甲基汞和乙基汞的標準曲線Tab le1 Linear equation，correlation coefficientand detection lim itof Hg2+，M eHg and EtHg

由表1可以看出3種不同形態的汞在1μg/kg～200μg/kg范圍內呈現出良好的線性關系且相關系數均大于0.999，二價汞、甲基汞和乙基汞檢出限分別為0.005、0.008mg/kg和 0.005mg/kg

2.7 方法學考察

2.7.1 精密度試驗

10次試驗結果的二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）RSD值分別為1.95%、1.67%，1.83%均小于2%，表明儀器性能穩定，精密度良好。

2.7.2 重復性試驗

10次試驗結果的二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）峰面積的RSD值分別為1.95%、1.67%，均小于2%，表明方法重復性良好。

2.7.3 穩定性試驗

計算結果顯示二價汞（Hg2+）、甲基汞（MeHg）峰面積的的RSD值分別為2.38%、2.75%，均小于3%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.7.4 加標回收試驗

樣品加標回收率見表2。試驗結果表明在牛肝菌樣品中，二價汞、甲基汞、乙基汞的6次平行測定值的相對標準偏差（RSD）均小于7%，加標平均回收率在72%～93%之間，表明加標回收率良好且具有良好的精密度。

表2 樣品加標回收率（n=6）Table2 Recovery testof Sam ple

2.8 實際樣品的測定

應用本文建立的方法對市售的5個批次牛肝菌樣品進行測定（表3）。結果表明在牛肝菌中主要以無機汞（Hg2+）的形式存在，含有少量甲基汞（MeHg）。該方法分離效果好，快速準確，具有檢出限低、靈敏度高、重復性好等優點。

3 結論

試驗建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測牛肝菌中不同價態汞元素的分離測定方法。樣品采用微波萃取結合HPLC-ICP-MS聯用的方法實現了對牛肝菌中不同價態汞元素的分離檢測，方法加標平均回收率范圍在72%～93%之間，相對標準偏差均小于7%，該方法操作簡便、分離效果好、檢出限低、靈敏度高、重復性好，檢測時間短，5min內能夠完全出峰，洗脫時間短，能夠在亞濃度（μg/kg）水平檢測不同價態汞元素；本研究可為今后制定野生食用菌中無機汞、甲基汞、乙基汞的標準檢測方法提供參考，同時也對完善食用菌質量控制、檢測方法及相關技術有重要意義。

表3 牛肝菌樣品中不同價態汞的含量Tab le3 The contentof Hg2+，M eHg and EtHg in Boletus fungi mg/kg

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