不同鹽濃度豆豉在發酵過程中抗氧化活性的變化

朱江煜，歐一琛，費立天

(揚州大學 食品科學與工程學院 營養與食品衛生學專業，江蘇 揚州 225000)

豆豉是一種以黑豆或黃豆為主要原料的傳統發酵食物，口味獨特，營養豐富，其中含有多種抗氧化成分，除少量的生育酚和維生素C外，還含有黃酮類和酚酸類化合物，以及在發酵過程中產生的多肽類和褐色色素類物質等[1,2]。隨著人們生活質量和消費水平的提高，豆豉的生理保健功能越來越受到消費者的重視，特別是抗氧化功能。有研究表明不同鹽濃度會對豆豉發酵的過程有所影響，從而導致抗氧化活性的變化。鹽濃度低，發酵周期短，產品易受微生物污染。鹽度太高則周期長，且鹽分含量高對健康不利，不為廣大消費者接受，因此合適的食鹽含量是發酵調味品生產的關鍵[3,4]。為了在發酵過程中更好地保證豆豉的抗氧化活性，本研究以黑豆為原材，研究了不同鹽濃度下，豆豉發酵過程中黃酮總量、鐵還原能力、羥自由基清除能力及DPPH自由基清除能力的變化，從而為豆豉工業化生產工藝優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：新鮮黑豆、食鹽，均為市售；米曲霉菌，來自揚州大學微生物實驗室。

1.2 試驗試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、硝酸鋁、醋酸鉀，均為分析純。

1.3 儀器與設備

TG328型分析天平、5415D型臺式離心機、YQ-120A型超聲波振蕩儀、HQ11D型便攜式pH、G100/G200型水平式恒溫水浴鍋、101-1型干燥箱、722N型分光光度計、6202型多功能粉碎機。

1.4 試驗方法

1.4.1 不同鹽濃度的豆豉的制作

取1.5 kg黑豆洗凈，常溫下浸泡7 h，放入滅菌鍋內，在121 ℃下加熱30 min，降溫到40 ℃待用，然后分成4組，每組600 g蒸熟的黑豆，按4%，8%，12%，16%的鹽濃度加入食鹽，然后按黑豆重的0.2%接入米曲霉菌三級種，攪拌均勻后立即取樣，其余樣放入35 ℃恒溫箱內，每隔3天取1次樣，第15天結束采樣。

1.4.2 樣液的準備

將樣品從恒溫箱中取出，初步搗碎后放入鼓風烘箱內50 ℃恒溫干燥3～4 h，直至樣品水分低于10%后取出，用多功能粉碎機粉碎，按質量比1∶30的比例加入80%的乙醇，進行超聲提取30 min，離心后過濾，得待測樣液[5]。

1.4.3 黃酮總量的測定

黃酮類化合物和蘆丁母核相似，吸光度測試效果相同，故用蘆丁標準曲線計算黃酮總量。

取5 mg蘆丁對照品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得標準溶液。精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，加入到10 mL容量瓶中，加蒸餾水補足，使各容量瓶中均含有5 mL液體，然后精密稱取0.3 mL濃度為5%的亞硝酸溶液，混勻放置5 min后加入0.3 mL濃度為10%的硝酸鋁溶液，再次放置5 min后，加2 mL濃度為4%的氫氧化鈉溶液，添加蒸餾水至容量瓶刻度線定容，再靜置10 min后，以無蘆丁樣為空白，在510 nm處測定吸光度值，繪制蘆丁標準曲線。

吸取待測標準液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶液至總體積為15 mL，依次加入硝酸鋁溶液1 mL、醋酸鉀溶液1 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，最后靜置1 h；以空白試液(精密吸取待測試料溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶液至總體積為15 mL，加水至刻度，搖勻)做參比，在415 nm處測定試料溶液的吸光度；根據所得標準曲線，按下式計算總黃酮含量[6]：

M=(m×d)/W。

式中：M為黃酮類化合物的總含量，mg/g；m為由標準曲線上查出的樣品比色液中蘆丁質量濃度，mg/mL；W為樣品的質量，g；d為稀釋比例。

1.4.4 鐵還原能力的測定

取2支試管，均加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH為6.6)和0.5 mL測試液，其中一支中加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，另一支中加入2.5 mL蒸餾水，搖勻后在50 ℃下水浴30 min，快速冷卻后均加入2.5 mL 10%三氯乙酸，然后放入離心機中在3000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL水以及0.5 mL 0.1%氯化鐵，靜置10 min后于700 nm處測定吸光度值，其中加鐵氰化鉀的樣液吸光度值記為Aa，加水的吸光度值記為Ab。

最后，Aa-Ab得到的吸光度差值At可以用來判斷鐵還原能力的強弱：差值越大，鐵還原能力越強；差值越小，鐵還原能力越弱。

1.4.5 羥自由基清除能力的測定

取3支10 mL比色管，第1支中加入0.5 mL的 10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL的 10 mmol/L 硫酸亞鐵、0.5 mL的待測液、8 mL的水和0.5 mL的10 mmol/L過氧化氫，搖勻，室溫放置20 min，在510 nm處測定吸光度值，記為Ax。第2支中以0.5 mL樣品提取液溶劑代替待測液，第3支中以0.5 mL水代替過氧化氫，其余同第1支，吸光度值分別記為A0和Ax0。羥自由基清除率的計算公式如下[7]：

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100。

1.4.6 DPPH自由基清除能力的測定

在試管中依次加入0.5 mL樣品提取液溶劑、3 mLDPPH產酸性蛋白酶乙醇溶液，混勻，避光，25 ℃水浴30 min，取出后在517 nm處測吸光度，記為Ai；以0.5 mL樣品加入3 mL無水乙醇按上述方法測吸光度，記為Aj；以0.5 mL溶劑加入3 mL DPPH乙醇溶液按上述方法測吸光度，記為Ac。測得數據后，清除率K的計算公式如下[8]：

K(%)=[Ac-(Ai-Aj)]/Ac×100。

1.5 數據處理

所有數據通過SPSS 19.0進行處理，實驗重復3次，數據以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 黃酮總量的變化

根據分光光度計測得數據，繪制蘆丁標準曲線，見圖1。根據標準曲線，計算出待測液中的黃酮總量，見圖2。

圖1 蘆丁標準曲線

圖2 不同鹽濃度豆豉發酵過程中黃酮總量

由圖2可知，同一鹽濃度的豆豉在發酵過程中其黃酮總量基本不變；不同鹽濃度豆豉的黃酮總量變化也不顯著。黃酮總量在1.51～1.78 mg/g之間，基本上處于不變的狀態，與前人結果相似[9]，細微的差異可能取決于原料豆的種類及酵母菌的差異。

盡管在本實驗中發酵前后不同鹽濃度豆豉中黃酮總量并未發生明顯的變化，但根據宋永生等的研究[10]，發酵處理會導致豆豉中異黃酮成分的改變，經過發酵處理的豆豉中黃豆苷元、染料木黃酮的含量會明顯增加，而黃豆苷、染料木苷的含量明顯降低。我們推斷，之所以發酵過程中黃酮總量最后沒有發生變化，可能是黃豆苷元、染料木黃酮的增加，抵消了黃豆苷、染料木苷的降低，最終導致黃酮總量基本沒受鹽濃度和發酵時間的影響。

雖然發酵處理對豆豉中異黃酮含量的影響并不顯著，但據報道，發酵作用下，糖苷型大豆異黃酮在β-葡萄糖苷酶的幫助下會部分轉化為游離型大豆異黃酮，使得游離型大豆異黃酮的含量明顯提高，糖苷型大豆異黃酮含量明顯降低。由于游離型大豆異黃酮的生物活性比糖苷型大豆異黃酮要高，所以發酵處理其實對于提高豆豉中黃酮物質的生理活性十分有效；但隨著鹽濃度的升高，β-葡萄糖苷酶活性會受到抑制，游離型異黃酮含量降低，導致大豆異黃酮的生物活性也發生降低。所以，在發酵處理中，鹽度盡管對豆豉黃酮總量并未發生影響，但生物活性卻會受到影響。

2.2 鐵還原能力的變化

鐵還原能力由2組溶液測得的吸光度Aa和Ab的差值At來判斷。差值At越大，鐵還原能力越強；差值At越小，鐵還原能力越弱。根據得到的數據，繪制成圖3。

圖3 不同鹽濃度豆豉發酵過程中鐵還原能力的變化

由圖3可知，在同一鹽濃度下，隨著發酵過程的進行，豆豉的鐵還原能力會逐漸變強；處于同一發酵時間，豆豉的鐵還原能力會隨著鹽濃度的提升而下降。

各鹽濃度最后一次取樣時，吸光度差值均遠高于發酵初期，原因可能在于發酵過程中，微生物在酶的幫助下不斷產生黃酮類和酚酸類化合物、還原性糖以及多肽類和褐色色素類物質，它們不斷增加，導致鐵還原能力在發酵過程中不斷加強[11]。

此外，在同一時間，低鹽濃度發酵的豆豉其鐵還原能力顯著高于高鹽濃度發酵。4%鹽濃度的豆豉在第15天取樣時，其鐵還原能力最強，吸光度差值達到了0.637；而同一時間16%鹽濃度的豆豉其吸光度差值僅為0.475。因為鹽濃度越高，酶活性降低，對微生物抑制越強，導致高鹽濃度豆豉中的還原性糖和酚類物質比低鹽濃度豆豉中的含量少很多，而還原性糖和酚類物質對鐵還原能力有促進作用，所以鐵還原能力也發生下降。

2.3 羥自由基和DPPH自由基清除能力的變化

羥自由基是一種在機體內危害作用最大的活性氧自由基，羥自由基清除率是反映豆豉抗氧化能力的重要指標[12]。在本實驗中，采取水楊酸法來測定羥自由基的清除能力，結果見圖4。

圖4 不同鹽濃度豆豉發酵過程中羥自由基清除能力的變化

由圖4可知，在同一鹽濃度情況下，豆豉發酵時間越長，羥自由基清除能力越強；而同一發酵時間，豆豉的羥自由基清除能力隨著鹽分的提升而變弱。在第15天時，4%鹽濃度的豆豉提取物的羥自由基清除率為35.72%，而16%鹽濃度的豆豉提取物中，其羥自由基清除率僅為22.32%。

圖5 不同鹽濃度豆豉發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH自由基清除能力的變化也基本一致。由圖5可知，剛蒸煮完畢的黑豆(0 天)及發酵處理15 天后的豆豉對DPPH自由基均有一定的清除效果，而發酵處理過的豆豉提取液的清除率遠遠高于未發酵的黑豆。這表明在黑豆及豆豉中，都存在著能夠作為電子供體的抗氧化性物質，從而與自由基反應使其結構穩定，中止自由鏈反應，減少破壞，而在發酵過的豆豉中，這些抗氧化物質的含量或種類是高于未經發酵的豆豉的。此外，與羥自由基清除實驗相似，在高鹽度下，豆豉的DPPH自由基清除能力也發生了降低，4%鹽濃度豆豉浸提液的DPPH自由基清除率高達58.67%，而16%鹽濃度中僅為36.35%，證明過量的鹽濃度可能會對這些抗氧化物質的含量和種類產生一些負面影響。

存在于黑豆中可清除自由基的成分有黃酮類和酚酸類化合物等。黑豆在曲霉發酵過程中進一步產生抗氧化物質，黑豆中的蛋白質和碳水化合物在多種酶的作用下進一步分解為多肽類、褐色色素類物質和還原性糖，此外，那些黃酮類化合物在β-葡萄糖苷酶的作用下會部分轉化為游離型異黃酮，其生物活性比糖苷型異黃酮要高[13]。這也解釋了發酵15天的豆豉的自由基清除能力高于未經發酵的黑豆的原因。此外，鹽濃度也是影響豆豉自由基清除能力的關鍵，高鹽濃度下，許多酶和微生物受到抑制，這些清除自由基的活性物質的產生也會相應減少[14]。

3 結論

在本實驗中，通過不同鹽濃度豆豉發酵前后黃酮總量、鐵還原能力、羥自由基及DPPH自由基清除實驗，最終得出以下結論：

豆豉在發酵過程中，其抗氧化活性得到很大的提升。

低鹽濃度發酵的豆豉的抗氧化性優于高鹽濃度的，本實驗中最佳鹽濃度為4%，在發酵15天后各抗氧化性指標達到最高，黃酮總量為1.62 mg/g，鐵還原實驗吸光度差值為0.637，羥自由基清除率達到35.72%，DPPH自由基清除率達到58.67%。

低鹽發酵避免了高鹽量對身體的不利影響，同時也保證了豆豉抗氧化性的最佳狀態，但低鹽發酵也會面臨著發酵周期長，不易保藏，風味易受到影響的問題，我們正致力于進一步優化豆豉的低鹽發酵，在保證生理活性的同時，也可以兼顧其他品質的要求，以更好地適應豆豉的商品化和市場化[15]。

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