C5a?C5aR在棕櫚酸誘導的小膠質細胞炎癥中的作用及機制

劉艷 徐三清 龍文君 盧慧玲

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科（武漢 430030）

近年來，母親長期高飽和脂肪酸飲食與子代神經系統發育異常之間的關系受到廣大學者的重視。母親攝入的飽和脂肪酸均可通過胎盤和母乳傳遞給胎兒及新生兒［1-2］。此外，血液中的脂肪酸能以游離形式彌散通過血腦屏障。研究［3-4］表明高脂飲食誘導的肥胖小鼠，脂肪組織C5a及C5aR表達明顯升高。C5a是補體C5的活化片段。高脂飲食可誘導補體系統激活，補體活化產物C5a通過與其受體C5aR結合，參與異常代謝信號誘發的炎癥反應［4］。但C5a?C5aR信號在暴露于母親高飽和脂肪酸飲食的子代腦組織炎性損傷中的作用及機制，還很少有研究涉及。研究表明，在原代培養的星形膠質細胞中給予飽和脂肪酸——棕櫚酸（palmitic acid，PA）干預后顯著增加星形膠質細胞炎性細胞因子 TNF?α、IL?6的釋放，給予 p44/42 MAPK（ERK1/2）抑制劑后，能阻止PA誘導的星形膠質細胞炎性因子的釋放［5］。表明飽和脂肪酸可能通過激活MAPK信號途徑中的ERK通路介導腦組織炎癥反應。但高脂誘發的C5a?C5aR激活是否也是通過ERK通路從而誘發小膠質細胞炎癥反應尚不清楚。

PA是飽和脂肪酸家族的重要成員之一。本實驗擬通過PA及C5aR拮抗劑干預原代培養的小膠質細胞，觀察ERK mRNA及蛋白、小膠質細胞炎性因子表達情況，旨在探討脂肪酸對小膠質細胞炎癥的影響及C5a?C5aR在此過程中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 出生后1 d的小鼠，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（鄂）2010?0009。熒光定量PCR試劑（Western Biotechnology），SYBR Green I（上海開放科技，中國），一抗：Iba1、ERK1/2、p?ERK1/2（Ab?cam），內參一抗（sigma，美國），二抗：羊抗兔IgG、羊抗小鼠 IgG（sigma，美國），TNF?α ELISA 試劑盒。熒光定量PCR儀 FTC2000（Canada），垂直板電泳轉移裝置（Bio?Rad，美國），圖像分析系統（LabworksTM Analysis Softwar，美國），電泳儀（Bio?Rad，美國），酶標儀（美國寶特Bio?Tek），酶聯免疫檢測儀（美國寶特Bio?Tek）。

1.2 小鼠小膠質細胞原代培養 新生24 h內清潔級小鼠，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。75%酒精消毒新生小鼠，在無菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH 7.2無鈣、鎂的D?Hank′s液的平皿中。無菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質，分離大腦皮層。用虹膜剪將組織剪切成1 mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用20 min。棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗2次。吸管輕輕吹打至肉眼觀察無明顯的腦組織團塊，靜置2 min。懸液收集于新的離心管，離心（1 000 r/min，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養液重懸，200目不銹鋼網過濾。置37℃、5%CO2培養箱培養24 h后更換一次培養基，以后每3天換一次液。

細胞培養14～16 d左右，在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質細胞培養物中出現細胞分層現象。用0.05%胰酶2～3 mL消化，待貼附在星形膠質細胞上的小膠質細胞脫離下來，將含漂浮的小膠質細胞的消化液轉入10 mL離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清；加定量完全培養再次吹打成細胞懸液，接種于預先包被的置有蓋玻片的24孔培養板，置于CO2恒溫細胞培養箱培養。生長24 h后吸掉培養液，以去除未貼壁的少突膠質細胞，加完全培養液繼續培養。

1.3 免疫組化檢測小膠質細胞Iba1表達 細胞用消化液消化后，用完全培養基重懸調整細胞密度至2×104/mL。在無菌的12孔板中鋪上細胞爬片。取細胞懸液分別滴到圓片上，讓細胞貼片30 min。在培養皿中補加完全培養液，37℃，5%CO2培養箱中培養。取出培養皿，用PBS漂洗2次；4%多聚甲醛固定20 min；PBS漂洗；1%Triton X?100 處理15 min；PBS漂洗；3%H2O2處理15 min；PBS漂洗。

山羊血清室溫封閉60 min；取出甩干封閉液；一抗孵育（稀釋比1∶200）4℃過夜。陰性對照用PBS液代替一抗；PBS清洗標本3次；生物素標記二抗工作液孵育37℃30 min；PBS清洗標本；堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液37℃30 min；PBS清洗標本；DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）10 min；蒸餾水洗2次；蘇木素復染5 min；自來水洗返藍；梯度酒精脫水75%、85%、95%、100%各3 min；二甲苯透明2次；中性樹膠封片。

1.4 QT?PCR檢測ERK1/2的mRNA表達 試驗共分 3組：對照組、PA（200 μmol/L）處理組、PA（200 μmol/L）+PMX53（100 nmol/L）處理組［5-6］。采用熒光定量PCR SYBR green I法進行檢測，引物見表1所示（mactin作為內參）。采用TRIzol試劑法提取細胞內總RNA，反轉錄mRNA為cDNA，采用20 μL體系進行逆轉錄，條件為：25 ℃ 10 min；42 ℃50 min；85 ℃ 5 min。熒光定量PCR采用50 μL體系進行擴增，擴增條件為：94℃4 min；94℃ 20 s、60℃30 s、72℃30 s循環35次，72℃檢測信號。

表1 熒光定量PCR引物列表Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer list

1.5 Western blot檢測Iba1、ERK1/2和p?ERK1/2蛋白表達 試驗分組同上。采用Western blot檢測Iba1、ERK1/2和p?ERK1/2蛋白在PA和PA+C5aR拮抗劑處理組中的表達。采用RIPA buffer裂解法對細胞進行裂解，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。對不同試驗組中的蛋白樣品進行SDS?PAGE電泳：4%的濃縮膠和10%的分離膠，樣品與5×SDS上樣緩沖液按4：1比例混合，混勻后沸水中煮5 min使蛋白變性。80 V跑過濃縮膠后轉換電壓至120 V，待溴酚蘭跑到膠板底部即可。電泳結束后采用PVDF膜進行轉膜實驗，將電流調整到恒流200 mA，轉移約1 h。

用封閉液將對應的一抗稀釋成一定的濃度（1∶500），內參一抗的稀釋終濃度為1∶3 000，然后溫育1.5 h。用TBST清洗3次，每次5 min。用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度（1∶3 000），然后溫育1.5 h。用TBST清洗4次，每次5 min。將A和B兩種試劑在試管內等體積混合，然后加在PVDF膜的正面，溫育大概2 min。進入暗室，PVDF膜上蓋一層保鮮膜，擦去多余的發光劑。依照發光的強度選擇不同的曝光時間將膠片放入顯影液中，出現條帶后，立即放入定影液中，流水沖洗膠片后晾干。對膠片進行掃描，用UVP凝膠圖象處理系統Labworks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.6 ELISA檢測TNF?α的表達 采用ELISA試劑盒檢測小鼠TNF?α的表達水平。首先制作各細胞因子的標準曲線，然后根據測定的各樣品OD值算出細胞因子數值。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism5對結果進行統計學分析，數據以均數±標準差表示，多組之間總體均數比較使用one?way ANOVA，兩組間比較采用 Student?t檢驗。

2 結果

2.1 小鼠小膠質細胞的原代培養及鑒定 本研究成功構建小鼠小膠質細胞的原代培養（圖1A），可用于后續實驗。免疫組化結果顯示，Iba1蛋白廣泛分布于小鼠原代小膠質細胞中（圖1B中棕色顆粒部分），表明小膠質細胞增殖狀態良好。

圖1 小膠質細胞原代培養及鑒定（×400）Fig.1 Microglia primary culture and identification（× 400）

2.2 PA及PA+PMX53干預后小膠質細胞Iba1表達情況 200 μmol/L PA干預后，小膠質細胞Iba1蛋白表達較對照組明顯提高（t=33.46，P＜0.001）；PA+PMX53組較PA組Iba1蛋白表達均有所下降（t=53.11，P＜0.001）。見圖2。

圖2 各組Iba1蛋白表達Fig.2 The expression of Iba1 protein

2.3 PA及PA+PMX53干預后小膠質細胞ERK1/2 mRNA及蛋白表達情況 PA組較對照組ERK1/2 mRNA表達明顯增加（t=13.3，P=0.005 6）；PA+PMX53組較PA組ERK1/2 mRNA表達下降（t=16.78，P＜0.001）。見圖3A。各組ERK1/2蛋白表達均無差異，見圖3B及3D。PA干預后，p?ERK1/2蛋白表達較對照組明顯升高（t=204.1，P＜0.001）；PA+PMX53組較PA組p?ERK1/2蛋白表達下降（t=147.9，P＜0.001）。見圖3C及3D。

圖3 各組ERK1/2 mRNA及蛋白表達Fig.3 The expression of ERK1/2 mRNA and protein

2.4 PA及PA+PMX53干預后小膠質細胞炎性因子表達情況 PA干預后，TNF?α表達均較對照組明顯升高（t=26.69，P＜0.001）；PA+PMX53組較PA組TNF?α表達均有所下降（t=9.55，P=0.000 7）。見圖4。

圖4 各組TNF?α濃度Fig.4 The concentration of TNF?α in different groups

3 討論

孕前期及孕期高脂飲食致母親肥胖可以導致兒童及青少年認知功能異常、注意力缺陷多動障礙和精神異常等［7］。關于母親長期高脂飲食導致子代神經系統發育異常的潛在機制并不清楚。有研究［8-9］認為與激發子代腦內與認知功能密切相關的部位如海馬及大腦皮質炎癥反應有一定關系。從側腦室注射飽和脂肪酸后，腦組織中炎性細胞因子TNF?α、IL?6及IL?1β表達明顯增加［10］。表明飽和脂肪酸可以誘導腦組織炎癥反應。本研究采用體外細胞實驗的方法，體外培養的小膠質細胞中加入PA干預后，小膠質細胞Iba1蛋白表達較對照組明顯增加，相應的炎性因子TNF?α濃度也顯著增加，表明PA誘導了小膠質細胞活化及炎癥反應。

近年來，通過對C5aR特異性拮抗劑PMX205及C5aR基因敲除模型（C5aR-/-）在中樞神經系統炎性疾病中的研究，更進一步證實C5a?C5aR信號在中樞神經系統病變中起著重要的作用。在宮內炎性暴露的早產兒腦損傷及缺血性中風模型中，C5aR基因敲除的小鼠和使用C5aR拮抗劑的小鼠則顯示神經元凋亡明顯減少，腦組織病變減輕［6，11］。用PMX205治療阿爾茨海默病12周后膠質細胞活化程度降低、Aβ聚集減少，記憶力改善［12］。PMX53是人工合成的環肽片段，也是C5aR的特異性拮抗劑，可阻斷C5a的主要生物學效應，在許多損傷及炎癥模型中被證實可減輕腦損傷、內毒素性休克、敗血癥、炎性腸病等多種炎癥性損傷，取得了比較肯定的效果［13-14］。本研究也觀察到，PMX53干預后，小膠質細胞Iba1蛋白表達及炎性因子TNF?α濃度均較PA組明顯降低，表明PA可能通過C5a?C5aR誘導的小膠質細胞活化及炎癥。

在中樞神經系統脫髓鞘病變中，C5a可通過激活星形膠質細胞和小膠質細胞的MAPK信號途徑中的ERK1/2通路，誘導炎性細胞因子和趨化因子釋放［15］。ERK是MAPK家族的重要成員，也是介導和調控細胞外信號到細胞內反應的重要激酶。ERK信號通路不僅與細胞的增殖和分化密切相關［16］，而且在炎癥反應中也具有重要作用［17］?？侲RK1/2包括磷酸化ERK1/2（p?ERK1/2）和非磷酸化 ERK1/2，p?ERK1/2是 ERK1/2的活性形式。ERK通路是否參與了PA誘發的C5a?C5aR激活及小膠質細胞炎癥反應？本研究結果顯示PA干預后，盡管ERK1/2蛋白表達較對照組無明顯差異，但ERK1/2 mRNA及p?ERK1/2蛋白表達較對照組明顯升高；而給予C5aR拮抗劑后ERK1/2 mRNA及p?ERK1/2蛋白表達較PA組有所下降，表明ERK信號的活化與C5a?C5aR激活有一定關系，但C5a?C5aR激活是否通過ERK信號活化來誘導小膠質細胞炎癥，尚需進一步研究如加用ERK的抑制劑。

綜上所述，本研究表明PA可誘發小膠質細胞炎癥反應，其作用機制可能通過C5a?C5aR，激活ERK1/2使其磷酸化，啟動ERK1/2MAPK信號轉導，進而激活小膠質細胞炎癥。C5aR拮抗劑在炎癥性損傷疾病具有神經保護作用。由于疾病的發展受很多條件影響，且在體內還有很多未知因素參與，所以僅通過體外實驗不能很好地解釋發病機制，在后期的實驗中，筆者一方面在體外實驗中增加ERK的抑制劑進一步闡明C5a?C5aR與ERK信號的關系，另一方面將通過體內實驗著手C5a?C5aR在孕前期及孕期高脂飲食母親子代腦組織炎癥中的作用及機制研究，從而為代謝性炎癥所致腦損傷性疾病研究提供策略與指導。

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