改良的高效液相色譜法測定酵母細胞中谷胱甘肽含量

陳良立 鄧艾平 杜維力 姚 鵑 李 嘯 劉秀繼 鄧張雙,,3

(1.三峽大學 生物與制藥學院 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司研發中心，湖北 宜昌 443003；3.華中科技大學 同濟醫學院藥學院，武漢 430030)

還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽硫醇化合物，在植物、微生物等眾多生物體中均有存在[1-3]．因為巰基的存在，還原型谷胱甘肽具有解毒、抗氧化、維持機體氧化還原平衡、調節細胞增生等重要生理作用[4,5]；但是，巰基易被氧氣、過氧化氫等氧化劑氧化形成二硫鍵而生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，喪失生理功能[6]．GSH來源于富含生物體的提取、化學合成和微生物發酵，其中酵母細胞發酵生產GSH是工業化的制備方式，被廣泛應用[7]．但是酵母發酵過程中細胞產生的大量氨基酸、小分子肽類和有機酸，對GSH含量準確檢測造成嚴重干擾，因此建立快速、準確的GSH和GSSG測定方法對調控GSH生產具有重要的意義．目前GSH和GSSG檢測方法主要以紫外分光光度法和HPLC方法為主[8，9]，其中紫外分光光度法靈敏度低、準確度差、巰基易產生假陽性干擾[10]；HPLC法則存在GSH保留時間過短、易與酵母細胞中其他成分疊加、峰型拖尾不對稱等缺點[11-14]．本文改進了HPLC檢測方法，延長了GSH的色譜保留時間，更加適合酵母中谷胱甘肽含量的準確測定．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母乳(安琪酵母股份有限公司提供，產品批號CF1727060)；還原型谷胱甘肽(中國藥品生物制品檢定所)；氧化型谷胱甘肽(中國藥品生物制品檢定所)；庚烷磺酸鈉(Fisher公司)；甲醇(色譜純)；磷酸二氫鉀(分析純)；磷酸(分析純)；其他試劑均為化學純．

1.2 儀器與設備

美國Waters高效液相色譜儀1525EF型，Waters 2489紫外檢測器；美國DIONEX高效液相色譜儀，UltiMate 3000紫外檢測器；Venusil XBP C18反相柱(5 μm×10×250 mm)；精密電子天平；超聲波清洗儀；pH計；溶劑過濾器．

1.3 實驗方法

1.3.1 GSH和GSSG標準溶液的配制

GSH儲備液配制：準確稱取GSH標準樣品80 mg加入去離子水溶解后于10 mL容量瓶中定容．

GSH標準溶液配制：吸取GSH儲備液5 mL，置于10 mL容量瓶中，以去離子水定容，配成4 mg/mL標準液，重復上述步驟依次配成2、1、0.5和0.25 mg/mL標準液．

GSSG儲備液配制：準確稱取GSSG標準樣品80 mg加入去離子水溶解后于10 mL容量瓶中定容．

GSSG標準溶液配制：吸取GSSG儲備液5 mL，置于10 mL容量瓶中，以去離子水定容，配成4 mg/mL標準液，重復上述步驟依次配成2、1、0.5和0.25 mg/mL標準液．

1.3.2 試供品溶液的配制

取安琪酵母股份有限公司生產的酵母乳1 g，加入10 mL去離子水，80℃下提取15 min，迅速置于冰水中冷卻置室溫，4 000轉下離心10 min，取上清液，即可得試供品溶液．

1.3.3 最佳檢測波長的確定

將配制好的0.5 mg/mL GSH標準液和GSSG標準液，在DIONEX紫外檢測器上進行波長掃描(190～600 nm)，確定檢測波長．

1.3.4 GSH和GSSG最低定量限的確定

再將GSH儲備液及GSSH儲備液稀釋，依次配成2、4、6、8、10 μg/mL的標準液，分別采用高效液相進行檢測，最終確定GSH的最低定量限及GSSH的最低定量限．

1.3.5 高效液相檢測方法的優化

將配制好的1 mg/mL GSH和GSSG標準液采用高效液相進行檢測，甲醇/水為洗脫體系(其中水相中添加庚烷磺酸鈉、磷酸二氫鉀，用磷酸在2.0～4.5范圍內調節pH值)，固定甲醇-水相的混合體積比，確定適合的pH值；調節甲醇-水相的混合體積比，固定水相的pH值，確定適合的混合體積比．

1.3.6 線性關系考察

準確吸取10 μL質量濃度為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的標準溶液，進行液相色譜分析．

1.3.7 精密度、準確度、回收率實驗

取高、中、低濃度GSH溶液和GSSG溶液10 μL，進行液相色譜分析，記錄各樣品色譜峰峰面積，測定日內、日間精密度(3d內)，計算回收率．

1.3.8 供試樣品測定

分別取同一批次生產的酵母乳3份，按照1.3.2方法制備供試品溶液，進行高效液相色譜分析．

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

將配制好的GSH和GSSG標準溶液，在戴安紫外檢測器上進行全波長掃描(190～600 nm)，谷胱甘肽在203 nm處有較強吸收，選擇203 nm作為檢測波長．

根據文獻[15]，采用甲醇-水相二元體系進行洗脫，其中水相中添加2.2 g/L庚烷磺酸鈉、6.8 g/L磷酸二氫鉀，磷酸調節pH值．本文改良了現有的測試方法，探索了緩沖鹽pH值(pH 2.0～4.5)對還原型和氧化型谷胱甘肽保留時間的影響．結果表明：pH值越小，谷胱甘肽的保留時間越長，峰型越尖銳對稱，測量結果越準確，適合pH值為2.5；固定水相pH值2.5，改變甲醇-水相混合體積比，甲醇含量越高谷胱甘肽保留時間越長，選擇甲醇-水相最優混合體積比為16：84．在最優條件下，可以使谷胱甘肽與雜峰有效分離且保留時間適中，適合快速準確分析．此條件下確定GSH和GSSG的最低定量限分別為6 μg/mL和4 μg/mL．

圖1 谷胱甘肽HPLC色譜圖

2.2 標準曲線的繪制

按照優化后的色譜條件，將配制好的GSH和GSSG標準溶液進行分析，進樣量10 μL，每個濃度重復3遍，以濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標，繪制標準工作曲線，通過計算求得GSH的回歸方程為y=12 506 660x+905 874，相關系數R2=0.999 7，GSSG的回歸方程為y=14 728 532x+1 240 685，相關系數R2=0.999 5，表明GSH和GSSG質量濃度在0.25～4 mg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系．

2.3 精密度、準確度、回收率實驗

將高、中、低濃度GSH溶液和GSSG溶液在上述色譜條件下測得的峰面積代入相應的標準曲線方程，計算出GSH和GSSG的濃度，計算回收率．以一天內5次測定GSH和GSSG濃度計算日內相對標準差，結果見表1．以3 d內3次測定GSH和GSSG濃度計算日間相對標準差，結果見表2．

表1 GSH和GSSG日內相對標準差

表2 GSH和GSSG日間相對標準差

對于樣品GSH而言，3種濃度的樣品日內和日間的相對標準差分別≤0.56%和≤0.92%，對于樣品GSSG而言，3種濃度的樣品日內和日間的相對標準差分別≤1.71%和≤0.96%．結果表明，該方法具有較好精密度、準確度和重復性．

2.4 酵母細胞中GSH和GSSG含量測定

酵母細胞經方法1.3.2處理后，采用該方法進行分析，分別檢測3批酵母樣品溶液中GSH和GSSG的含量，平行試驗3次，結果見表3．

表3 不同批次酵母乳中谷胱甘肽含量測定

3 結 論

針對已有報道的緩沖鹽體系[11，15]，本文通過調節流動相pH值和二元相配比的方法，優化了酵母細胞中GSH和GSSG色譜檢測方法，而此方法確定的樣品濃度，適合酵母細胞中GSH和GSSG的檢測，同時可以避免其他方法例如DTNB法測定含量時，巰基帶來的假陽性干擾．應用該分析方法，GSH色譜峰鋒形尖銳對稱、保留時間延長、避免了干擾峰與GSH的重疊；同時該方法準確度高、重復性好，適用于GSH的快速準確分析檢測．

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