廣西人群中神經突起生長抑制因子基因rs2968795G/A和rs10496040A/C多態性分析*

王 榮 覃海媚 楊鳳蓮 韋葉生 王俊利

(右江民族醫學院,1 附屬醫院,2 檢驗科,3 生殖遺傳實驗室,百色 533000)

在2000年,Chen等[1]首次分析從牛的脊髓中獲得的NI250同源物,繼而克隆出了神經突起生長抑制因子(neurite growth inhibitor,Nogo)基因。Nogo屬于網狀蛋白(reticulon protein,RTN)家族的第4 成員,即RTN4。Nogo基因受不同的轉錄方式可翻譯成3種蛋白異構體,包括Nogo-A、Nogo-B及Nogo-C。研究顯示Nogo基因多態性和多種腫瘤等疾病密切相關。關于Nogo基因rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點遺傳多態性的研究,尚未見報道。但是,不同遺傳背景的人群對疾病的易感性表現不同。故本研究建立SNaPshot法和DNA測序技術檢測這兩個位點的基因型,并分析其多態性在不同人群中的差異。這不僅能豐富人類Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C的遺傳多態性資料,也可為深入探討同一疾病在不同人群中的易感性差異提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取本院體檢中心323例無血緣關系的體檢者,包括181例男性與142例女性,年齡17～76歲。臨床檢查及實驗室指標均在正常范圍內。所有的研究對象均來自廣西地區。研究方案在本院倫理委員會批準后進行,研究對象均簽署知情同意書。

1.2 樣本DNA制備

用EDTA-K2抗凝采血管采集上述研究對象的靜脈血3ml,在4℃條件保存。采集標本48h內,取200μl標本按照血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技公司)進行DNA提取,-20℃保存待用。

1.3 引物合成

參考NCBI數據庫中Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C的堿基序列,運用Primer 3.0在線引物設計軟件(http：//primer3.ut.ee/)設計所需特異性引物,由上海生工公司合成。rs2968795G/A位點的上游引物：5-CAGTCTGGTGGCAGAGTATGCTAAA GA-3,下游引物：5-GACAGGATTGTGCTCTCTCAC ACAA-3,延伸引物：5-CAGTCTGGTGGCAGAGTA TGCTAAAGA-3;rs10496040A/C位點上游引物：5-TGCATATCAC AGAGCAAATTCATACCA-3,下游引物：5-AGTGAATACAGTGTACCTTTTGAGA GC-3,延伸引物：5-AGTGAATACAGTGTACCTTT TGAGAGC-3。

1.4 基因型檢測

PCR反應體系為20μl,包括：1.0μl DNA、1×GC buffer I (Takara Inc.)、2.5mmol/L Mg2+、0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L 上、下游引物、1U HotStarTaq聚合酶 (Qiagen Inc.)。PCR反應程序：95℃ 2min,94℃ 20s,65℃ 30s,72℃ 1min,循環11次。94℃ 20s,59℃ 30s,72℃ 1min,循環24次。PCR產物經SAP酶和EXOI酶純化后繼續延伸反應。SAP酶純化延伸產物后在ABI3730XL測序儀上樣,用Polyphred軟件分析結果。采用DNA測序法證明分型結果。

1.5 統計學處理

采用基因直接計數法計數基因型及等位基因頻率。哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)定律檢驗樣本人群是否有代表性。用χ2檢驗或Fisher精確檢驗比較各組基因多態性分布差異,運用SPSS 17.0統計軟件處理數據。

2 結果

2.1 rs2968795G/A和rs10496040A/C基因分型

rs2968795G/A和rs10496040A/C基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P=0.342;P=0.466,P>0.05),表明樣本人群有代表性。rs2968795G/A和rs10496040A/C的擴增長度分別為313bp、567bp。分型結果顯示,rs2968795G/A位點存在GG、GA、AA3種基因型,頻率分別為18.9%,46.1%,35.0%;rs10496040A/C位點存在AA、AC、CC3種基因型,頻率分別為1.2%,16.4%,82.4%。DNA測序結果和基因分型相符合(圖1)。

圖1 Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C測序圖Fig 1 Sequencing map of genotype for Nogo gene rs2968795G/A and rs10496040A/C polymorphismA：The inverted triangles of panels ①-③ indicated GG,GA and AA genotypes of Nogo gene rs2968795G/A,respectively；B：The inverted triangles of panels ①-③ indicated AA,AC and CC genotypes of Nogo gene rs10496040A/C,respectively

2.2 廣西人群中2位點的基因多態性分布

rs2968795G/A位點GG、GA、AA基因型及G、A等位基因頻率分布在男女兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。rs10496040A/C位點AA、AC、CC基因型及A、C等位基因頻率分布在男女兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 廣西人群Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C基因型及等位基因頻率分布(%)Tab 1 Distribution of genotype and allele frequencies of Nogo geners2968795G/A and rs10496040A/C in Guangxi population (%)

2.3 2位點多態性與其他種群的基因多態性比較

廣西人群rs2968795G/A位點基因型和等位基因分布頻率與歐洲人及非洲人相比,差異均有統計學意義(P<0.05)。與北京人和日本人相比,差異無統計學意義(P>0.05);廣西人群rs10496040A/C位點基因型及等位基因分布頻率與歐洲、非洲和日本人之間差異均有統計學意義(P<0.05),與北京人相比差異無統計學意義(P>0.05)(表2、3)。

表2 Nogo基因rs2968795G/A位點基因型及等位基因頻率在不同人群間的比較Tab 2 Comparison of the frequency of Nogo gene rs2968795G/A polymorphism in different ethic and regional groups

表3 Nogo基因rs10496040A/C位點基因型及等位基因頻率在不同人群間的比較Tab 3 Comparison of the frequency of Nogo gene rs10496040A/C polymorphism in different ethic and regional groups

3 討論

Nogo基因定位于人類第2號染色體上(2p13-14),長度約75kb,含有14個外顯子(長度為47～2400bp)和8個內含子(長度為19bp～37kb)[2]。Nogo基因的轉錄受2種啟動子調控,其中啟動子1負責啟動Nogo-A/B的轉錄,啟動子2負責Nogo-C的轉錄。其中Nogo-A在抑制中樞神經軸突再生和參與腫瘤細胞凋亡中發揮重要的作用。Nogo-B在中樞神經系統及外周組織均有表達,涉及腫瘤細胞凋亡、組織損傷修復和血管內皮再生等病理生理過程。而Nogo-C主要在骨骼肌中表達,在腦、心、肝和脂肪組織也有部分表達,但具體功能尚不十分明確[3-4]。Teng等[5]在神經母細胞瘤細胞的凋亡實驗中研究表明,Nogo-A蛋白可抑制神經母細胞瘤細胞的凋亡,在神經母細胞瘤細胞生長過程中起促進作用。Zhang等[6]研究顯示rs34917480CAA插入/缺失多態性和子宮肌瘤有相關性,其純合子增加子宮肌瘤的患病風險。Shi等[7]報道rs71682890缺失型純合子降低了宮頸鱗狀細胞癌的患病風險。袁微等[8]研究顯示,rs1012603C/T位點的多態性和缺血性腦卒中相關,T等位基因可能是缺血性腦卒中的易感基因。因此,分析和闡明Nogo基因多態性在不同人群中的分布特征,可為深入研究不同人群中Nogo基因多態性與疾病的發生發展間的關系提供分子遺傳學理論基礎。

單核苷酸多態性是指在基因組DNA序列中由單個核苷酸改變而引起的多態性,是可遺傳變異中最常見的一種,占所有已知多態性的90%以上。不同遺傳背景的人群的基因多態性呈現不同的差異,這使得許多學者熱衷于探索群體遺傳的多態性分布[9-10]。本研究結果表明,廣西人群Nogo基因rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點的基因型和等位基因頻率在不同性別間比較差異均無統計學意義,表明廣西人群中的這兩個位點的多態性可能和性別無相關性。進一步將兩位點的多態性結果與HapMap公布的不同人群比較,顯示廣西人群rs2968795G/A的基因型及等位基因頻率與歐洲人和非洲人間差異均有統計學意義,而與北京人和日本人比較差異無統計學意義。廣西人群rs7575107G/T位點基因型及等位基因分布頻率與歐洲、非洲和日本人之間差異均有統計學意義(P<0.05),與北京人相比差異無統計學意義(P>0.05)。引起這種差異可能原因是廣西地處我國南方邊界,環境相對外界封閉,有獨特的地貌和生活習慣[11]?？傊?rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點多態性在不同人群中分布呈不同程度的差異。rs2919126C/T和rs7575107G/T位于Nogo基因的內含子區,內含子的基因突變可以影響基因的轉錄效率,進一步影響蛋白的表達,從而參與疾病的發生發展過程[12]。這種差異可能影響一些相關疾病在不同人群間所反映出不同發病率及臨床表現。

近年來,隨著分子生物學技術的進步,人們發現不同的遺傳背景表現出對疾病的易感性和預后質量呈現出不同差異,這也使得更多學者開始研究基因多態性和疾病間的密切關系。本研究首次開展對廣西人群Nogo基因rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點多態性的研究,同時并和不同人群進行比較。為其與相關疾病的研究奠定了基因水平上的基礎數據。選取的研究對象來自廣西地區,多態性的結果具有一定的區域代表性。此外,由于通婚的普遍性,很難明確到研究對象的具體民族。今后,將深入探討Nogo基因的單核苷酸多態性和疾病的關系。

參 考 文 獻

[1] Chen M S,Huber A B,van der Haar M E,et al.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature,2000,403(6768)：434-439.

[2] Liu G M,Luo Y G,Li J,et al.Knockdown of Nogo gene by short hairpin RNA interference promotes functional recovery of spinal cord injury in a rat model[J].Mol Med Rep,2016,13(5)：4431-4436.

[3] Schmandke A,Schmandke A,Schwab M E.Nogo-A：multiple roles in CNS development,maintenance,and disease[J].Neuroscientist,2014,20(4)：372-386.

[4] Xu W J,Shen G Q,Li Q.Biological function of Nogo-B[J].Sheng Li Xue Bao,2013,65(4)：445-450.

[5] Teng F Y,Tang B L.Nogo/RTN4 isoforms and RTN3 expression protect SH-SY5Y cells against multiple death insults[J].Mol Cell Biochem,2013,384(1-2)：7-19.

[6] Zhang K,Bai P,Shi S,et al.Association of genetic variations in RTN4 3′-UTR with risk of uterine leiomyomas[J].Pathol Oncol Res,2013,19(3)：475-479.

[7] Shi S,Zhou B,Wang Y,et al.Genetic variation in RTN4 3′-UTR and susceptibility to cervical squamous cell carcinoma[J].DNA Cell Biol,2012,31(6)：1088-1094.

[8] 袁微,王耀輝,蒙蘭青,等.神經突起生長抑制因子A基因多態性與缺血性腦卒中患者遺傳易感性的研究[J].中華老年心腦血管病雜志,2014,16(7)：682-685.

[9] 李文娜,李克研,宋慧娟,等.西藏藏族人群白細胞介素1β基因-511C/T多態性[J].解剖學雜志,2014,37(1)：92-94.

[10] 盛優靜,余冰,耿芝,等.性激素結合球蛋白基因單核苷酸多態性在寧夏回、漢族人群中的分布特征[J].解剖學雜志,2016,39 (1)：86-90.

[11] 梁燕冰,彭丁偉,黃雨晴,等.廣西人群EPCR基因3′-非編碼區rs9574 C/G位點的多態性[J].臨床與實驗病理學雜志,2017,33(3)：249-252.

[12] Jo B S,Choi S S.Introns：the functional benefits of introns in genomes[J].Genomics Inform,2015,13(4)：112-118.

(編輯: 劉 芳)