2016年新疆尉犁縣羊藍舌病的診斷

丁夢玥 ，馬曉菁 ，葉 鋒 ，劉 帥 ，薛新梅 ，宋迎春 ，加帕爾·哈斯木 ，易新萍 ，劉麗婭，孟肖瀟，馬俊杰 ，谷文喜*，鐘 旗*

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆尉犁縣畜牧獸醫工作站，新疆 尉犁縣 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州動物疾病控制與診斷中心，新疆 庫爾勒 841000）

藍舌?。╞luetongue，BT）是一種由呼腸孤病毒科環狀病毒屬的藍舌病病毒（BTV）引起的急性病毒性傳染病，是一種經由吸血昆蟲庫蠓、伊蚊等媒介昆蟲叮咬傳播的、嚴重侵害反芻動物的非接觸性蟲媒病[1]。世界動物衛生組織（OIE）規定藍舌病為A類傳染病，我國規定為一類傳染病。藍舌病不僅可以通過昆蟲傳播，還可以通過精液和胎盤屏障垂直傳播。該病主要侵害綿羊，表現為體溫升高、口鼻腔黏膜水腫及舌發紺，有明顯的臨床癥狀，死亡率為5%～35%，亦可感染山羊、牛、鹿及其他野生反芻動物，但多呈隱性感染，臨床癥狀不明顯[2-3]。

該病18世紀首次出現于南非好望角，隨后陸續蔓延至其他地區，至今除南極洲外，其他各大洲皆有藍舌病的流行，主要的疫區主要集中在歐洲、中東和北非這3大疫區[4]。目前發現藍舌病共有27種血清型(BTV-1～BTV-27)，型與型之間缺乏有效的交叉保護作用，不同血清型的流行情況與地域有著緊密聯系。我國已發現7種血清型，其中BTV-1型和BTV-16型為我國的主要致病血清型[5]。

新疆于1989年首次在全疆范圍內進行了藍舌病的流行病學調查，不同物種的總陽性率為2.64%[6]，2012年再次對新疆8個地（州）進行了流行病學調查，其中尉犁縣羊的陽性率最高為3.33%[7]，這說明新疆是廣泛存在藍舌病的，而且有感染率逐年增長的趨勢。本研究是在新疆尉犁縣建立一個藍舌病血清學檢測為陰性的哨兵動物群，分別于2016年和2017年的7月-11月每周采血1次，進行BTV血清抗體檢測，監控哨兵動物群藍舌病感染情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BTV抗體檢測試劑盒（c-ELISA）和抗原檢測試劑盒（Ac-ELISA）由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供。TransZol Up總RNA提取試劑盒和EasyScriptROne-Step RT-PCR SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 哨兵動物群的建立及樣品的采集

對新疆尉犁縣某養殖場的羊進行BTV血清學抗體檢測，選取檢測結果為陰性的10只山羊和10只綿羊組成哨兵動物群。于2016年7月-11月每周采樣1次，共采集血清和肝素鈉抗凝血各303份。血清-20℃保存，抗凝血4℃保存。

1.3 引物合成

BTVVP7基因的引物序列由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供，引物序列:BTV-VP7 F:5'-GTTAAAAATCTATAGAGATG-3’/BTV-VP7 R:5’-GTAAGTGTAATCTAAGAGA-3’。

1.4 BTV血清學抗體檢測

按照BTV c-ELISA試劑盒說明書，取出4℃保存的ELISA板條，設陰、陽性對照、空白對照（PBST）各2孔，按2孔/樣加入待測血清，先后加入競爭性抗體和酶標二抗，孵育，洗板，加入TMB顯色液避光顯色10～15 min，加入終止液，用酶標儀在OD450 nm處讀值，依照說明書上的公式，計算血清樣品的抑制率。

1.5 病毒的分離

選取轉陽樣品、轉陽前一周樣品及轉陽后一周樣品的肝素鈉抗凝血，加入1 mL PBS，洗滌5次，1000 r/min離心10 min，棄上清。再加入1 mL 1%雙抗的高純水，渦旋破碎紅細胞，孵育30 min，5000 r/min離心10 min，取上清接種于培養好的BHK-21細胞上，37℃5%CO2培養箱中培養，盲傳5代。對于出現CPE的孔，則吸取細胞液進行后續研究，盲傳5代后未出現CPE的棄去。

1.6 病變細胞液中BTV抗原的檢測

按照BTV Ac-ELISA試劑盒說明書，用試劑盒中的山羊抗BTV包被抗體包被ELISA板，洗滌，設陰、陽性對照、空白對照（PBST）各2孔，按2孔/樣加入待測血清，放入溫箱37℃孵育1 h 30 min。洗板，依次加入兔抗BTV血清競爭液，綿羊抗兔酶標二抗，孵育，洗板，拍干。加入TMB顯色液，避光顯色10 min。加入終止液。用酶標儀在OD450 nm處讀值。

1.7 病變細胞液BTV VP7基因片段的RT-PCR擴增

用TransZol Up總RNA提取試劑盒提取病毒總RNA，用One-Step RT-PCR試劑盒，以變性后的總RNA為模板，以BTV-VP7 F和BTV-VP7 R為引物，擴增BTV VP7基因片段。

反應程序:45 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s）×40；72 ℃ 10 min；4℃保存。

2 結果

2.1 監控群BTV血清學抗體檢測

2016年共采集羊血清303份，共檢測出2份陽性血清，陽性率為0.66%。這2份陽性血清都為10月采集。

2.2 病毒的分離

在接種BHK-21細胞盲傳三代后，有14份樣品出現CPE，表現為細胞變圓、團聚、脫落，形成空斑，多數細胞死亡（圖1），表明接種的樣品中存在病毒粒子，致使BHK-21細胞出現CPE。

圖1 接種分離株后BHK-21細胞病變

2.3 病變細胞液中BTV抗原的檢測

對出現CPE的14份細胞液進行BTV抗原捕獲ELISA檢測，14份細胞液均為BTV陽性，表明確實存在BTV粒子。

2.4 病變細胞液BTV VP7基因片段RT-PCR擴增結果

瓊脂糖凝膠電泳分析BTV VP7基因的RT-PCR擴增產物，在1156 bp處均有一條清晰目的條帶，與預期結果相一致（圖2）。表明擴增BTV VP7的基因片段，而引起CPE出現的病毒為BTV。

圖2 病變樣品BTV VP7基因片段RT-PCR擴增結果

3 討 論

我國于1979年首次在云南省師宗縣檢測出綿羊藍舌，之后相繼在安徽?。?985年）、四川?。?989年）、湖北?。?983年）等29個省均檢出BTV血清陽性畜。從1979年起直至1991年前，藍舌病的爆發區域還主要集中在長江以南，1991年和1993山西省報道了藍舌病的感染情況[8，9]，由此可以看出從1979年我國首次發現藍舌病開始，該病已經漸漸跨越過長江，向北傳播至華北地區和西北地區。新疆于1988-1989年首次采用瓊脂糖凝膠擴散實驗方法對藍舌病進行了普查，共普查17個地（州）86個縣（市），平均陽性率為2.53%，其中山羊陽性率較高為17.04%，綿羊陽性率為1.77%[9]。新疆畜牧科學院獸醫研究所于2012年再次對新疆8個地州的8個縣市進行藍舌病調查，羊血清BTV檢出率為1.32%，其中尉犁縣陽性率最高為 3.33%[7]，證明藍舌病在新疆長期存在，且廣泛流行。 尉犁縣位于 N40°10′33″～41°39′17″，處于藍舌病流行的緯度帶上，從本研究對哨兵動物群BTV抗體變化的結果來看，僅10月出現2份陽性樣品，這可能與當地氣候有關。

由于BTV的存活時間在血清中較長而在動物體內較短，通常是動物感染BTV轉陽前、后1～2周可以分離到病毒，超過2周就無法分離到病毒。本研究在監測哨兵動物群的BTV轉陽情況的同時，對轉陽前、后1～2周的樣品進行了病毒的分離，成功分類到了14株羊源藍舌病毒，14株病毒除1株為從綿羊分離到的外，剩下的都為山羊身上分離到的毒株，說明分離到的藍舌病毒可能對山羊有較強的感染性，后續還需對分離到的藍舌病毒進行進一步的分型研究和鑒定。

本研究通過設置哨兵動物群，監測抗體變化并進行細胞分毒，最后成功分離到14株羊源性BTV，所分離到的藍舌病毒毒株還需進行進一步的鑒定及測序，進一步的分析血清型是否與已發現的血清型一致，為繼續調查研究新疆BTV病原及其流行特征提供科學依據。

參考文獻:

[1]林麗琴，呂敏娜，孫銘飛，等.廣東某奶牛場藍舌病病毒分離株血清型與基因型的鑒定[J].中國獸醫科學,2016，（6）:615-621.

[2]殷麗霞.藍舌病的研究現狀[J].吉林畜牧獸醫,2009,30(5):8-10.

[3]王榮亮,胡騎,信愛國.藍舌病病原分子生物學及免疫學研究進展[J].中國畜牧獸醫,2011,38(8):177-181.

[4]何宇乾,吳海燕,徐瓊.藍舌病的流行現狀[J].中國獸醫科學,2012,42(05):537-540.

[5]張勝男,常建華,韓明浩,等.藍舌病的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2015,(19):57-60.

[6]秦其英,邰振國,王力儉,等.新疆動物藍舌病流行病學調查及病毒分離鑒定[J].云南畜牧獸醫,1991(3):79-80.

[7]王玉,谷文喜,石保新,等.2012年新疆藍舌病血清學調查及區間分布[J].中國動物檢疫,2014,31(5):52-55.

[8]韓明浩.內蒙古地區2015年牛羊藍舌病流行病學調查及病毒的初步分離鑒定[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2016:2.

[9]舒展，劉帥，加帕爾·哈斯木，等.新疆地區羊藍舌病流行病學調查與分析[J].草食家畜，2017，(1):47-51.

[10]張勝男,常建華,韓明浩,等.藍舌病的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2015,(19):57-60.