HBVpreC/C區基因突變與原發性肝癌預后的關系

吳忱思 吳建華 趙樂 王英南 張風賓 張衛國 張瑞星

050011石家莊,河北醫科大學第四醫院消化內科(吳忱思、趙樂、王英南、張風賓、張瑞星),實驗動物中心(吳建華)；050011石家莊,河北醫科大學《臨床薈萃》編輯部(張衛國)

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全球范圍內發病率第5位的常見惡性腫瘤,每年約有70萬人死于肝癌,該病易復發、預后差,其死亡率位居惡性腫瘤第2位[1]。目前,HCC的發病機制尚未完全明確,有研究表明,肝臟炎癥程度、腫瘤病理類型、腫瘤數量、腫瘤大小和脈管瘤栓,是評價肝癌患者預后的獨立預測因子[2-3]。在亞洲和非洲,肝細胞肝癌患病率呈逐年上升趨勢,其主要和這些區域乙型肝炎病毒感染流行有關,在亞洲,肝癌約80%以上是由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所致。因此,HBV與HCC之間的關系已成為原發性肝癌研究領域的熱點。

HBV是一種嗜肝病毒,據世界衛生組織報道,全球每年大約有100萬人死于其感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。根據乙型肝炎病毒的全基因序列差異(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536),已經鑒定出了A～J 10個基因型,其中,在東亞,HBV主要為B和C基因型[4]。在我國,HBV感染率高,大約9 300萬人是HBV攜帶者,3 000萬人患有慢性乙型病毒性肝炎[5]。HBV基因組包含四個重疊的開放讀碼框(open reading frame,ORF),即P、X、pre S/S、pre C/C 基因區,分別編碼聚合酶蛋白、X蛋白、外膜蛋白和核殼蛋白。由于缺少HBV聚合酶的校正,HBV DNA非常容易發生基因突變[6-7]。HBV基因突變與肝癌發病風險的關系已經被廣泛研究[8-11],但是HBV基因突變與HBV-HCC預后關系的研究則相對較少。Kim等[12]研究發現基本核心啟動子(the basal core promoter,BCP)區域的A1762T/G1 764 A突變與乙肝相關性肝細胞肝癌的預后相關,本研究擴展到HBV preC/C區基因,探討其突變位點與HCC預后的關系。

1 材料與方法

1.1 收集肝癌組織標本和提取HBV DNA81例癌組織標本均來自于2007—2009年在河北醫科大學第四醫院行手術治療的HBV-HCC患者。標本采集經患者或家屬知情同意?；颊吣挲g30～86歲,其中女性患者10例,男性患者71例,中位年齡54歲,患者均排除其他肝臟疾病(如自身免疫性肝炎、HCV感染等)并被證實感染HBV。實驗過程經過河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準。用Promega公司DNA試劑盒提取基因組DNA,并置于-20℃冰箱備用。

1.2 PCR擴增及基因測序應用Life Technologies公司的ABI 7300 TaqMan平臺,通過多重PCR法測出HBV-HCC患者癌組織的HBV基因型。并通過NCBI數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536)查找引物(見表1),對 HBV preC/C區的DNA序列進行擴增,將其產物純化處理后進行測序分析。采用雙向重復測序方法對同一標本進行測序分析。

1.3 統計學方法應用χ2檢驗、Kaplan-Meier、Logrank test、和Cox回歸分析對統計數據進行處理分析。所有的統計處理操作均應用IBM公司的SPSS 18.0軟件,Ρ＜0.05被認為差異有統計學意義。

表1 HBV preC/C區基因PCR擴增和測序引物Tab.1 Primers used in PCR amplification and sequencing in the preC/C region gene

2 結果

2.1 HBV-HCC患者的臨床特征對接受手術治療的81例HBV-HCC患者術后進行隨訪,時間為3年,每3個月隨訪1次,將其進行基因分型如下：46例為B型,35例為C型。分析其臨床特征與術后生存期之間的關系,結果顯示門脈瘤栓、腫瘤分期和腫瘤大小與HBV-HCC患者的生存相關(見表2)。并將以上3個因素引入Cox比例風險模型,進行多因素方差分析,結果顯示門脈瘤栓、腫瘤分期和腫瘤大小被確定為與HBV-HCC患者術后生存相關的獨立危險因素。

表2 HBV-HCC患者的臨床因素Tab.2 The analysis of clinical factors in HBV-HCC patients

2.2 HBV preC/C區基因突變與生存的相關性本研究對HBV preC/C區的DNA序列進行基因測序。使用Log-rank test和Cox比例風險模型分析HBV突變與HBV-HCC生存之間的關系,發現18個位點的突變頻率大于5%(見表3),應用Log-rank test和Kaplan-Meier進行分析,在這18個位點中,7個位點(1915、2134、2176、2221、2260、1979、2245)與HBV-HCC患者術后生存相關。如表3所示,以下5個突變位點具有顯著的統計學差異,被確定為預測HBV-HCC患者生存相關的獨立危險因子：1915位點(P=0.024),2134位點(P=0.006),2176位點(P=0.002),2221位點(P=0.001)和2260位點(P=0.016)。另外,1979和2245突變位點與HCC患者的生存具有臨界統計學差異：1979位點(P=0.098),2245 位點(P=0.052)。 將 1915、2134、2176、2221、2260和2245位點與臨床因素相關聯進行多因素方差分析,由于1979位點P值較大故未引入進行多因素方差分析,結果顯示 1915位點(RR：0.195,95%CI：0.044～0.855,P=0.030)存在明顯統計學差異,而2 221 位點(RR：2.815,95%CI：0.918 ～8.632,P=0.070)存在臨界統計學差異(表4)。

表3 與HBV-HCC術后患者生存相關的HBV preC/C區基因突變位點Tab.3 HBV preC/Cregion mutations associated with postoperative survival in HBV-HCCpatients

表4 與HBV-HCC術后患者生存相關的臨床特征與HBV preC/C區基因突變位點Tab.4 Multivariate analysis of clinical characteristics with postoperative survival in HBV-HCCpatients and the HBV preC/Cregion mutations

3 討論

HBV屬嗜肝DNA病毒科,HBV非常容易發生基因突變。既往研究發現HBV突變主要集中在HBV基因組的特定區域,例如基本核心啟動子BCP區、pre S/S區和pre C/C區[13]。本研究重點觀察HBV DNA序列中HBV preC/C區,研究該區域基因突變位點與HBV-HCC預后的關系,并通過統計分析鑒定出與HBV-HCC生存相關的7個突變位點。結果表明,HBV preC/C區基因突變不僅與HCC發生有關,也與HCC患者術后生存相關。

目前,HBV感染在東南亞地區非常普遍,已經成為威脅人群健康的主要問題[14]。HBV preC/C區基因是HBV四個ORF之一,其主要編碼乙型肝炎e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)和核心蛋白。BCP區中的突變G1 896 A和A17 62T/G1 764 A雙突變,可使HBeAg表達下降[15]。在過去的幾年中,有研究明確了導致HCC的兩個HBV突變位點[16-17]。其中,G1 896 A和C2 288 A可以引起氨基酸殘基的突變。然而,只有G1 896 A已經被深入地研究,G1 896 A突變導致preC/C區基因第28位密碼子由TGG變為終止密碼子TAG,通過該突變可以將終止密碼子引入preC/C區基因的開放閱讀框,從而阻止HBeAg的產生,并且研究顯示該突變與肝癌發生相關[17]。HBV preC/C區基因共同編碼HBeAg,HBeAg可以刺激機體產生抗體,其抗體在細胞免疫和體液免疫中發揮著清除HBV的作用,Gl896 A突變使得preC基因不能與C基因共同編碼轉譯出完整的HBeAg,從而導致病毒逃逸機體對病毒的免疫清除作用[18-19]。Kim等[12]證實可以引起密碼子突變的HBV preC/C區基因突變位點與HCC相關,該研究結果還表明,在HBV preC/C基因區,除了G1 896 A導致密碼子突變與HCC相關之外,仍然存在與HCC相關的突變位點。因此,為了深入研究HCC相關的突變位點及其作用機制,需要從人體試驗和實驗室水平進一步驗證并闡明。

本研究中,在HBV preC/C區基因中鑒定出了與HBV-HCC生存相關的7個突變位點：1915,2134,2176,2221,2260,1979和2245。這些突變位點在肝癌的發病機制中發揮著重要作用。Rajesh等人在對印度北部HBV感染者基因型研究中也發現了A19 15G突變。Akuta等[21]研究發現C基因區2134位點突變可作為判斷HBV抗病毒藥物治療是否有效的獨立預測因子。荊永正等人[22]研究發現乙型病毒性肝炎患者C222 1T突變出現在C基因區,未導致氨基酸突變,為同義突變。C基因編碼HBc Ag(hepatitis B virus c antigen,HBcAg),它可以刺激機體產生相應的抗體,HBcAg表達于肝細胞膜表面,C基因的突變可導致HBcAg抗原位點改變,從而形成細胞毒T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對HBcAg的識別逃逸,這是HBV感染肝細胞后清除病毒及造成肝損傷的重要機制之一[23]。近年來,多項研究表明程序性死亡因子l(programmed death 1,PD-1)和程序性死亡因子配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)是參與腫瘤免疫逃逸的重要環節,且與T淋巴細胞免疫功能缺陷相關,HBcAg可以通過JNK、ERK和P13 K/AKT信號通路促進PD-1的高表達,而高表達的PD-l促進HBV特異性CD8+T淋巴細胞凋亡和抑制其抗病毒功能[24]。并且大量研究表明HCC腫瘤組織中PDL1表達水平顯著升高[25-26]。PD-1與PD-L1結合后可導致T細胞凋亡,從而引起免疫逃逸狀態,促進HCC的形成[27]。本研究對于HBV DNA突變位點的研究分析,鑒定出與HCC預后關聯的HBV preC/C區基因突變位點,為肝癌的預防和治療提供了新的靶點,有利于鑒別預后不良的肝癌患者,及早進行治療及干預,對于提高肝癌患者的生存期、改善其預后具有重要的意義。

利益沖突無