蝌蚪紅細胞微核試驗在水環境污染狀況監測中的應用

王 剛 ，蔣 潔，常國亮，劉 洋

(1.淮陰師范學院 科技處； 2.淮安市科學技術情報研究所 項目管理中心；3.淮陰師范學院 生命科學學院；4.淮陰師范學院 設備處，江蘇 淮安 223300)

國外學者曾用蔭魚[1]、銀大馬哈魚、有尾目肋螈幼體等作為實驗動物[2]檢測水體污染研究；我國也有學者先后使用黃鱔、鯽魚、泥鰍、蝌蚪等作為實驗動物進行微核試驗，從而檢測水中致變物的致變效應[3-5]，國外研究結果表明，運用蝌蚪血紅細胞微核試驗進行水污染檢測，是比較理想、有實用價值的生物指示器，可以檢測水體中低濃度污染物[6].本人所在實驗室以前使用蝌蚪進行過類似的紅細胞微核試驗，測定并報道了里運河水以及淮安市不同區域河流水質誘發蝌蚪紅細胞微核及核異常的研究[7-8]，本實驗選擇從淮安市區到楚州區的3條主要河流的河水為檢測對象，采用中華大蟾蜍蝌蚪進行紅細胞的微核試驗，對淮安市市區到楚州區不同區域水質污染情況進行監測，以進一步了解淮安市及周邊不同區域主要水質的污染情況和程度，從而為地方水環境的監測和治理提供初步的理論依據.

1 實驗

1.1 材料

中華大蟾蜍變態期的蝌蚪，體重0.2g左右，2016年4月初采于淮安市桃花島內的一段未受污染的河流中.染毒前10天，置于曝氣后的自來水內飼養，水體溫度保持在20～22℃.一周換水2次，每天使用磨細的飼料喂養一次，做試驗時選擇處于變態期發育狀態良好蝌蚪為實驗材料.

1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械五廠)、JNOEC XS-212-202顯微鏡、XSJ-HS電腦顯微分析系統(Panasonic WV-CP240攝像頭)、SARTORIUS BS423S電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司).

1.3 方法

1.3.1 藥品及其配制

1)固定液

甲醇原液(GB 683-79分析純，南京建設化學試劑廠產品).

2)Giemsa染色液

稱取Giemsa粉(Q/GHSC 1092-97，上海試劑三廠產品)0.25g，甘油(GB687-77化學純，上海制皂廠出品，上?；瘜W試劑采購供應站試劑廠分裝)16.5mL，甲醇16.5mL.首先將少量甘油倒入Giemsa粉中，使用研缽研磨至無顆粒，再將剩余的甘油全部倒入，最后將甲醇加入并混勻，用濾紙過濾.將混合液放在56℃水浴2h使其充分溶解.用時取1mL加19mL 1/15mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.81)即成15%的Giemsa染液.

3)1/15mol/L磷酸緩沖液(pH=6.81)

稱取0.272g KH2PO4(GB1274-77化學純，上海試劑二廠產品)，稱取0.716g Na2HPO4·12H2O(GB1263-77分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠產品)，加蒸餾水60mL，混勻即可.

1.3.2 采水及預處理

對照組為經暴氣后的淮安市自來水，A處為淮安市區里運河(淮海路段與黃河路交叉點)；B處為淮安市開發區古淮河水(大同路和水渡口大道交叉點)；C處為淮安市楚州區城區文渠水(大八字橋至北水關段)；D處為淮安市楚州區城區蕭湖水(河堤東側)；采水時間為2016年6月；水樣預處理方法為自然沉淀后待用.

1.3.3 實驗分組

對照組為經暴氣后的淮安市自來水，實驗組用A、B、C、D四組水樣，每一組水樣均分為原樣100%、50%、33.3%三個濃度，用暴曬后的自來水配置，飼養密度每組20只/300ml.

1.3.4 染毒

選擇來源相同，發育狀況體重相似的蝌蚪隨機放入每一試驗水樣中.每組投放20只蝌蚪，染毒時間均為一周，染毒一周后，蝌蚪全部存活，轉移到經暴氣后的自來水中，6h后處死制血涂片.每一濃度中隨機取6到10只蝌蚪進行處理.每一組中，挑選20只來源相同，發育情況、體重、個頭等基本情況一致的蝌蚪隨機放入試驗水樣中.染毒一周后蝌蚪全部存活，然后，將蝌蚪全部放入經過暴曬的自來水，靜養6h，并從每一種濃度中挑選6-10只處死，制作血涂片，以便實驗使用.

1.3.5 血涂片的制備

取蝌蚪，用紗布將其體表的水分吸干(防止血細胞破裂)，在軀干和尾巴連接處斷尾，取血，涂片，自然晾干，用甲醇固定液固定15min，15%的Giemsa染液染色15min，流水沖洗后用電熱吹風機吹干[9].

1.3.6 數據記錄及結果分析

將做好的血涂片置于顯微鏡底下進行觀察，尋找涂片均勻區域，每張片子需要觀察2000個細胞，觀察后記錄微核和核異常細胞數量.結果統計時，使用千分率(‰)表示.微核試驗中鑒定微核及核異常方法參考有關文獻[10].

微核細胞率=具有微核的細胞總數/觀察細胞總數×1000‰；

核異常細胞率=具有核異常(除微核)的細胞總數/觀察細胞總數×1000‰；

將以上實驗數據均做統計學方面分析(獨立性檢驗)[11].

2 結果與分析

不同區域水質對蝌蚪紅細胞微核的影響結果見表1.

從表1可知，生活在對照組中的蝌蚪，其紅細胞的微核細胞率為0.112‰；A、B、C、D原液四組水質引起蝌蚪紅細胞的微核細胞率分別為0.386‰、0.625‰、1.475‰、0.224‰，它們分別是對照組的3.44、5.58、13.17、2.00倍，與對照組相比較，除D組外，A組有顯著性差異(P<0.05)，B、C組都有極顯著性差異(P<0.01)(見圖1).

圖1 不同區域水質誘發蝌蚪紅細胞微核細胞率的比較

不同區域水質對蝌蚪紅細胞核異常的影響見表2.從表2可知，對照組的蝌蚪紅細胞核異常細胞率為0.441‰，四個實驗組原液的核異常細胞率分別為2.053‰、3.026‰、3.475‰、1.162‰，它們分別是對照組的4.66、6.86、7.88、2.63倍，與對照組比較，除D組楚州城區蕭湖水與對照組無差異(P>0.05)外，A組有顯著性差異(P<0.05)，B、C組都有極顯著性差異(P<0.01) (見圖2).

3 討論

微核試驗(micronucleus test， MN)是依據環境污染物能夠引起細胞DNA損傷、誘發染色體畸變，從而在細胞核外形成微核的道理，以便檢測污染物中誘變物質對染色體損傷的一種簡單可行的方法.其原理是由于外源物質的干擾，染色體發生斷裂，在細胞分裂過程無著絲點的染色體斷片，無法正常進入到子細胞中，這樣在細胞核外就產生了微小的核，涂片染色后，統計細胞微核率，檢測染色體受損傷的程度，從而間接反映化學物的遺傳毒性.

本實驗之所以選擇蝌蚪作為實驗動物，是因為它具有如下5個優點：(1)蝌蚪易于采集，數量較多，基本上無成本，且易于觀察和實驗.(2)蝌蚪紅細胞體積較大，分裂旺盛，對環境污染物反應相當靈敏.(3)蝌蚪對環境質量變異極其敏感，因為蝌蚪體表很薄、與水體完全接觸，且沒有保護性的隔離(如魚的鱗片、昆蟲的殼等)結構.(4)蝌蚪體內因為擁有轉化前誘變劑或前致癌劑為具有活性成分的微粒體活性系統，除了對檢測水體中的直接致突變物有較好適用性外，還可以檢測水體中的前致突變物[12].(5)蝌蚪微核試驗對水中單因子致突變效應和污水中混合污染物的聯合致突變效應都具有較好的適用性，擁有很高的實用價值[13].

表2 不同區域水質引起蝌蚪紅細胞的核異常比較

圖2 不同區域水質誘發蝌蚪紅細胞核異常細胞率的比較

實驗發現，不同地區河水誘發蝌蚪血紅細胞微核率呈現不同的特點.從表1可以看出， C組(淮安區城區文渠原液)微核率最高，達1.475‰，為對照組的13.17倍，二者差異極顯著(P<0.01)；A(市區)、B(開發區)組(均為原液)次之，其微核率分別為 0.386‰、0.625‰，與對照組相比， A組有顯著性差異(P<0.05)，B組都有極顯著性差異(P<0.01)；D組微核率為0.224‰，與對照組相比無明顯差異(P>0.05).據查，四條河水污染程度不同主要是因為沿岸污染源分布不一.C組(楚州城區文渠河)是環城的一條主干河流，人口密集，居民眾多，排入此河流的污染源主要有生活垃圾和糞便以及一些工廠排放的工業廢水、廢渣和廢氣，從而造成河水的嚴重污染；B(開發區)組河水污染程度處在市區里運河與城區文渠河之間；A組(市區里運河)從市區穿過，地處經濟繁華地帶，城市生活污水成分復雜，有生活日常垃圾和糞便、洗滌劑以及各種病原微生物等，并且此處有排污口，污水源源不斷向河中排放；D組(蕭湖)是位于淮安城區蕭湖公園的一條河流，污染相對少一些.生活污水中的各種成分聯合作用導致了蝌蚪紅細胞的致突效應.首先，各種有機污染物的降解，需要消耗水中溶解氧氣，直接造成水中缺氧，從而造成影響蝌蚪生長緩慢等情況，誘發蝌蚪體內染色體受損而產生微核；其次，在降解不飽和脂肪酸自身氧化過程中，會產生大量游離原子團、過氧化物、氫氧化物等，這些物質氧化性很強，攝入這些污染物，可引發蝌蚪產生微核與核異常[14].研究結果發現，不同濃度的河水致變蝌蚪血紅細胞微核率不同.置于對照組中的蝌蚪，紅細胞微核率僅為0.112‰，不同濃度河水水質處理后，微核率的上升幅度與濃度成正比，濃度越高，微核率越高.淮安城區文渠組1/3稀釋度微核率為0.172‰；1/2稀釋度微核率升高為0.286‰；而原液組微核率高達1.475‰，呈明顯的劑量效應關系.

實驗發現，細胞除產生微核外，同時出現了其他方面的核異常.核異常包括核質外凸、核固縮、核內凹、核變形、無核、雙核、核碎裂、核內空泡、無絲分裂及小核等，是一種綜合性的核損傷指標.實驗表明在試驗組微核率較高，出現核異常率亦較高.與此同時，我們還在微核率高的組中發現雙微核和三微核等現象，這從某種程度上反映出遺傳物質損傷的加重.該現象表明，核異常和多微核也可以作為檢測致變效應的指標.本實驗結果表明，淮安市區到淮安區的3條主要河流(市區里運河、開發區河水、淮安城區文渠水)的河水均含一定量的致突變活性物質，并且3個地區的河水的含量呈現出遞增趨勢，尤以淮安城區水體致突變性最高.這3條主要河流致變物的含量已經在一定程度上對沿岸百姓生活和農業生產構成了威脅，希望地方環保部門、有關廠商及時采取相關治理措施，迅速改善地方水質，為當地人民提供健康的保證.

[參考文獻]

[1]Kligerman A.D.,et al.Umbra limi:amodel for the study of choromosome aberrations in fishes[J].Mutation Res，1975，31(4):225-233.

[2]Jaylet A，et al.A new micronucleus test using peripheral blood erythrocytes of the new t pleurodeles walt to detect mutagens in fresh-water pollution[J].Mutation Res，1986，164(4):245-257.

[3]劉愛華，等.魚類血細胞的微核測定[J].動物學研究，1985，6(1):8-10.

[4]樓允東，等.亞硝基胍對泥鰍紅細胞微核及核異常的誘發[J].中國環境科學，1986，16(4):275-278.

[5]賀維順，等.一種水質污染生物監測的新方法-蝌蚪腸細胞染色體畸變分析[J].環境科學學報，1987，7(4):467-470.

[6]湯新慧.串場河水誘發蝌蚪血紅細胞微核的研究[J].江蘇預防醫學，1997，7(1):83-86.

[7]周雪瑞.里運河水對蝌蚪紅細胞微核率及核異常率的影響[J].江蘇預防醫學，2005，16(4):102-105.

[8]周雪瑞.淮安市不同區域河流水質誘發蝌蚪紅細胞微核及核異常的研究[J].淮陰師范學院學報，2005，4(4):62-65.

[9]耿德貴，等.除草劑乙草胺對蝌蚪紅細胞微核及核異常的影響[J].環境與健康雜志，2000，17(1)：36-38

[10]耿德貴，等.四種除草劑對中華大蟾蜍蝌蚪紅細胞微核及核異常的影響[J]．動物學雜志，2000，35(1)：12-16.

[11]李春喜，王志和，等.生物統計學[M].北京：科學出版社，2000.

[12]苑宇哲，等.應用蝌蚪快速檢測環境變異的兩種方法——微核試驗和單細胞凝膠電泳[J].四川動物，2004，23(1)：74-80.

[13]賀維順，王蕊芳.蝌蚪血紅細胞微核和核異常監測水質污染的研究[J]．動物學研究，1990，11(1)：1-6.

[14]劉清華，等.肝癌高發區飲用水對蝌蚪紅細胞微核率影響的研究[J].廣西預防醫學，1999，4(5):72-74.