發酵麥麩對面包面團生化特征及烘焙學特性的影響

楊文丹 Wen-dan - 莊 靚 楊紫璇 - 蔣 慧 徐 巖 鄭建仙 - 黃衛寧 -

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室, 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室, 江蘇 無錫 214122；3. 華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

膳食纖維能預防多種現代病，如糖尿病、肥胖癥等[1]，因此越來越受到消費者的關注[2]，作為西方主流食品的烘焙食品是膳食纖維的良好載體[3]。麩皮是一種成本較低且富含膳食纖維的烘焙原料，而將麩皮應用到面包生產中存在巨大的挑戰[4-5]。嚴曉鵬等[6]發現復配型酶制劑通過協同作用降解麩皮中的纖維素和木聚糖，可減少其對面團的劣化作用，強化面筋結構，提高面團柔軟度；熊俐等[7]提出纖維素主要影響新鮮面包品質，而木聚糖酶可以延緩麩皮面包老化。由此可見，酶在高膳食纖維面包制作過程中起著重要的作用[8]。

馬克斯克魯維酵母(MarxKluyveromyces)是一種新型的食品安全級酵母，相比傳統釀酒酵母，它除了具有生長快，生物量高，耐高溫等特點[9]，還可以利用麩皮、玉米漿等發酵生產酶類、乙醇及其它活性成分[10]。有研究表明馬克斯克魯維酵母在底物誘導下能夠分泌木聚糖酶、葡聚糖酶[11]及β-葡萄糖苷酶[10]等纖維素水解酶，在工業發酵領域存在巨大的應用潛力。面包面團中富含多糖、蛋白等多種成分，這些分子在面包制作過程中發生復雜的相互作用，面團體系的化學組分及流變學特性都會發生相應變化[12]。目前，關于馬克斯克魯維酵母發酵麥麩作為功能配料在烘焙產品中的應用未見報道。

本研究選用馬克斯克魯維酵母發酵麥麩制得富含天然酶的功能配料，分析麥麩發酵過程中的生化變化，并將其用于高膳食纖維面包制作中，旨在評估馬克斯克魯維酵母發酵麥麩中的天然酶對面包面團品質的影響，為開發天然、營養的高膳食纖維面包功能配料提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

麥麩：河北省辛集市福之園面業有限公司；

高級面包粉：中糧面業(秦皇島)鵬泰有限公司；

馬克斯克魯維酵母(MarxKluyveromyces)：ATCC36534，上海一研生物科技有限公司；

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)：化學純，國藥集團化學試劑有限公司；

福林酚試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

木聚糖：優級純，美國Sigma公司；

攪面缸：SM-25型，新麥機械(無錫)有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HHS-21-4型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

混合實驗儀：Mixolab2型，法國Chopin公司；

發酵流變儀：F3型，法國Chopin公司；

質構儀：CT3型，美國Brookfield公司；

冷場發射掃描電子顯微鏡：SU8220型，日本HITACHI公司；

物性測試儀：TA·XT2i型，英國Stable Micro System公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵麥麩的制作 將馬克斯克魯維酵母在YM培養基中活化至對數后期，于4 000 r/min離心10 min，收集菌泥并洗滌2次；用無菌生理鹽水將菌泥配制成4×107CFU/mL懸浮液。取100 g麥麩，接種12 mL菌懸液調制成DY190的麥麩面團，在30 ℃培養箱連續培養48 h，每6 h取樣，直接用于酸度、菌落數和酶活測定。

1.2.2 面包面團的制作

(1) 麥麩面包面團(bran dough, BD)：80%高筋粉和20%麥麩。

(2) 馬克斯克魯維酵母發酵麥麩面包面團(fermented bran dough, FBD)：80%高筋粉和20%發酵24 h的麥麩。

(3) 木聚糖酶改良面包面團(bran dough with xylanase, XBD)：80%高筋粉，20%麥麩和木聚糖酶(60 U/100 g)。

(4) 復合面包面團(fermented bran dough with xylanase, FXBD)：80%高筋粉，20%發酵24 h的麥麩和木聚糖酶。面團攪拌后(10 min)，醒發后(2 h)及焙烤后(冷卻2 h)分別取樣，進行冷凍干燥及磨粉處理，過80目篩用于化學分析。

1.2.3 pH及總可滴定酸度(TTA)的測定 根據AACC方法(2000)02-52，分別取10 g發酵麥麩于錐形瓶中，加入90 mL 蒸餾水，磁力攪拌30 min，靜置10 min，測定pH。用0.1 mol/L的NaOH 滴定至 pH 8.6，消耗的NaOH體積即為TTA，每個樣品至少重復操作3次。

1.2.4 酵母菌數的測定 按GB 4789.15—2010執行。

1.2.5 酶活測定 取5 g發酵麥麩于離心管中，加入20 mL醋酸鈉緩沖液(0.5 mol/L、pH 5.0)混合均勻，于30 ℃搖床提取60 min，并在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液4 ℃ 儲藏備用。根據DNS法，分別以木聚糖[13]和羧甲基纖維素(CMC)[14]為底物測定木聚糖酶和纖維素酶活力。1個酶活力單位(U)定義為：每分鐘底物轉化為1 μmol木糖/葡萄糖所需的酶量。分別以木糖/葡萄糖標準曲線計算酶活。參照Espinoza等[15]的方法，將500 μL粗酶液加入到600 μL預熱的阿魏酸甲酯溶液(2 mg/mL)中，在45 ℃下保溫10 min，將1 mL反應混合物加入到2.5 mL終止劑(10 mmol/L 甘氨酸緩沖液，用NaOH調節pH至10)中，空白組以緩沖液代替酶液。在325 nm下測定吸光值，以1 000～1 500 mmol/L阿魏酸繪制標準曲線；1個酶活力單位定義為：每分鐘產生1 μmol 阿魏酸所需的酶量。

1.2.6 可溶性糖含量變化 采用間苯三酚法[16]測定面包面團中可溶性阿拉伯木聚糖(WEAX)含量。稱取0.1 g粉，加入30 mL去離子水超聲提取20 min，沸水提取30 min，提取液4 000 r/min離心10 min，收集上清液到100 mL容量瓶；用30 mL去離子水洗滌沉淀，室溫震蕩10 min，離心并合并上清液，定容至100 mL。采用苯酚-硫酸顯色法[17]測定樣品中可溶性碳水化合物含量。

1.2.7 游離酚的釋放量 稱取面包面團樣品5.0 g，加入70 ℃ 預熱的70%甲醇溶液25 mL，玻璃棒攪拌均勻，70 ℃下浸提10 min，不斷攪拌，冷卻后于4 000 r/min離心20 min，殘渣重復提取1次，合并上清液定容至50 mL，錫紙包好備用。取0.5 mL提取液，加入2.5 mL福林酚試劑，迅速加入2.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，室溫避光反應60 min，在765 nm處測定吸光值[16]。

1.2.8 面團表觀黏度 將1.2.1中松弛后的適量面團放進質構儀專用盒中，盒蓋穿孔可調底。樣品通過蓋子擠壓抬高底部直至被擠壓到1 mm厚。擠壓停止后，通過降低頂部釋放壓力。1 min松弛后，玻璃探頭下降擠壓面團表面。將探頭從面團表面分離所需要的力記錄下來。每個樣品重復10次及以上，面團的黏度即讀取的面團黏度平均值。

1.2.9 面團熱機械學特性 采用混合試驗儀對面包面團攪拌性能進行測定。采用Chopin+協議對5個面團的吸水率、面團形成時間和穩定時間進行測定。

1.2.10 面團發酵特性 采用發酵流變儀測定面包面團延伸特性和持氣能力。取面團250 g放入發酵籃中，測試條件：溫度38 ℃，面團重量250 g，砝碼2 000 g，測試時間3 h。每個樣品至少重復3次，取平均值。

1.2.11 掃描電鏡 挑取2 g醒發后(2 h)的面團置于青霉素瓶中進行固定(3%戊二醛)，用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)漂洗3次后，再次進行固定(1%四氧化二鋨)，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L)進行反復沖洗后，再用不同濃度的乙醇(30%，50%，70%，90%，100%)進行梯度洗脫，最后用醋酸異戊酯對乙醇進行置換，再經過干燥、離子濺射噴金等處理后，用掃描電鏡進行觀察。

1.2.12 面包烘焙品質分析 將1.2.1中的4種面團在38 ℃/85% 條件下醒發100 min，放進烤箱(170 ℃/210 ℃)焙烤20 min，冷卻2 h后，采用菜籽替代法對面包比容進行測定，按式(1)計算比容；用切片機將面包切成1 cm的均勻薄片，取中央完整均勻的兩片面包進行全質構測定。

(1)

式中：

s——比容，mL/g；

v——面包體積，mL；

m——面包質量，g。

1.2.13 數據分析 采用 SPSS 17.0 及Excel 2016 分析軟件進行數據統計分析，運用方差分析法(ANOVA) 進行顯著性分析，顯著差異水平取P≤0.05。

2 結果與討論

2.1 麥麩發酵過程中酸度變化及酵母菌生長情況

由圖1可知，發酵前期(0～18 h)馬克斯克魯維酵母經過短暫停滯期后即進入對數增長期，活菌數量從1.7×106CFU/g 增長至1.3×108CFU/g，產酸量也不斷積累；發酵中期(18～30 h)，酵母菌生長處于穩定期，活菌數保持在108CFU/g；發酵后期(30～48 h)，酵母菌發生明顯衰敗，可能還伴隨著雜菌的生長。發酵過程中，樣品中可滴定酸(TTA)含量從7.8 mL(0 h)上升至18.8 mL(48 h)，增加了141%，而pH值僅下降了7.81%，說明馬克斯克魯維酵母在發酵過程中釋放了有機酸，且麥麩具有較強緩沖能力[18]。值得一提的是，發酵麥麩酸度增加主要發生在發酵前期(0～18 h)和發酵后期(30～48 h)，可能是前期酵母菌生長旺盛，釋放或激活多種水解酶類產生大量有機酸；而后期產酸主要是腐敗菌導致的，與菌落生長情況保持一致。

馬克斯克魯維酵母通過改變環境pH值影響了各種水解酶活力，有學者認為酸面團低pH(3.9～4.1)環境會激活面粉中蛋白酶和淀粉酶活力[19]，而阿魏酸酯酶和β-葡萄糖苷酶最適pH為5.0～7.0[20]。纖維素降解酶(內切、外切β-葡聚糖酶)最適作用pH值相對較低(5.0)[21]，植物內源性木聚糖酶最適pH 6.0～6.5[22]。當然，發酵麥麩的pH值受到菌株來源、發酵條件及原料組成的影響。

2.2 麥麩發酵過程中酶活力變化

纖維素酶可以破壞纖維素非結晶區，隨機水解β-1,4-糖苷鍵將較長的纖維素分子鏈降解成具有還原性末端的小分子片段及單糖[23-24]。如圖2所示，隨著發酵時間的延長，纖維素酶活力先增加后下降，發酵6 h時纖維素酶活力增加至3倍，發酵后期(30～48 h)纖維素酶活力保持在較低水平(0.300 U/g)，可能與酶底物抑制有關[25]。麥麩本身具有較高的內源性木聚糖酶活力(0.238 U/g)，與Gurpreet等[14]研究結果相近。發酵前期(0～12 h)，發酵麥麩面團中木聚糖酶活力發生明顯的上升，酶活力最高達0.354 U/g。伴隨著發酵時間的延長，木聚糖酶活力受到抑制，發酵后期(30～48 h)木聚糖酶活力低于0.100 U/g。

圖1 發酵麥麩pH、TTA和酵母菌數量的變化Figure 1 pH, TTA and microbial counts during fermented process of wheat bran

由圖2還可以看出，隨著發酵時間的延長，阿魏酸酯酶活力略有提高隨后降低；發酵36 h時，發酵麥麩中阿魏酸酯酶活水平最高為0.16 U/g，相比發酵0 h酶活提升了39%。但是，在本研究中馬克斯克魯維酵母發酵麥麩代謝的阿魏酸酯酶活力遠低于黑曲霉[26]等。研究[27]表明，阿魏酸酯酶活性與體系pH值密切相關。酵母菌發酵麥麩時酸化作用較弱且麥麩具有較強緩沖能力，體系pH值維持在6.0左右[圖1(a)]，接近肉桂酰酯酶最適pH值(7.0)，而乳酸菌發酵產生大量的有機酸(pH 4.0左右)抑制了肉桂酰酯酶活性。

圖2 發酵麥麩中纖維素酶、木聚糖酶和阿魏酸酯酶活力的變化

Figure 2 Cellulase, xylanase and feruloyl esterase activities during fermented process of wheat bran

2.3 面包制作過程中可溶性糖和游離酚含量變化

表1、2中顯示了原料、面團及面包中WEAX含量的變化情況。小麥粉、麥麩中WEAX含量分別為3.24，8.01 mg/g，經過24 h發酵的麥麩中WEAX含量增加了2.23倍(P≤0.05)。在和面階段強烈的機械攪拌作用下，面團中各組分得以充分混勻，木聚糖酶與底物充分接觸反應。富含天然酶的發酵麥麩面團(FBD)和木聚糖酶面團(XBD)中WEAX含量分別比BD高出45%和36%，FXBD面團中WEAX含量最高，達到6.68 mg/g，說明發酵過程代謝的木聚糖酶和添加的木聚糖酶對WEAX含量增加具有協同作用。醒發及焙烤后，4種面團中WEAX含量都有明顯增加(醒發后增加范圍為11%～34%；焙烤后增加范圍為45%～62%)，這是由在醒發過程中和焙烤初期，麥麩內源性木聚糖酶和微生物來源木聚糖酶持續作用引起的，尤其在焙烤初期，木聚糖酶的活力與其耐熱性密切相關[28]。Priscilla等[29]研究表明，大部分的水不溶性阿拉伯木聚糖(WUAX)在攪拌和醒發過程中發生溶解，焙烤過程中部分WEAX會與其他組分通過化學鏈接或物理纏繞變得不可溶。

水溶性碳水化合物包括可溶性淀粉、纖維素、半纖維素、果膠等糖類物質，WF中主要的碳水化合物是淀粉，且含量遠高于WB。經過馬克斯克魯維酵母發酵，FB中可溶性碳水化合物含量略有上升(表1)。相比BD，FBD和FXBD具有較高的可溶性碳水化合物含量，這是因為發酵促進難溶性纖維素的降解。木聚糖占碳水化合物比例較低，因此木聚糖酶對水溶性碳水化合物含量影響非常小。醒發后，面團中可溶性膳食纖維含量有所降低，可能是可發酵糖類作為酵母碳源被利用。但是不可否認的是，醒發過程中面團中纖維素降解酶類仍然會發生作用。焙烤后，面包中水溶性碳水化合物進一步降低，可能是由于還原糖類和氨基化合物發生了美拉德反應生成一些難溶性聚合物。

表1小麥粉、麥麩及發酵麥麩中可溶性糖和游離酚含量?

Table 1 The content of soluble sugar and free phone of wheat flour, wheat bran and fermented wheat ran

原料樣品WEAX含量/(mg·g-1)可溶性總糖含量/%游離酚含量/(μg·g-1)WB8.01b8.21a1 610b FB25.89c8.94a2 780c WF3.24a31.43b577a

? WB為麥麩；FB為馬克斯克魯維酵母發酵24 h的麥麩；WF為小麥粉。同一列數據中標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P≤0.05)。

由表1可知，麥麩(WB)中游離酚酸含量高達1 610 μg/g(約是WF的2.8倍)，經過24 h發酵麥麩(FB)中游離總酚含量增加至1.7倍。面團面包制作過程中游離總酚含量與WEAX含量變化趨勢相同，這都歸因于內源或者外源纖維素酶對細胞壁的廣泛降解作用[30]。

表2 面團攪拌、醒發和焙烤過程中可溶性糖和游離酚含量的變化?Table 2 The change of the content of soluble sugar and free phone of dough during bread making

? 同一列數據中標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P≤0.05)。

2.4 面團微觀結構

4種麥麩面團(BD、FBD、XBD和FXBD)經過2 h醒發后分別在不同放大倍數的掃描電鏡下觀察，結果見圖3。從BD面團中可以觀察到明顯的粗纖維片段，這些片段從空間位置上阻斷了面筋的連續性，面筋結構呈現出斷裂、稀疏且不均勻。這可能是由于大量的難溶性阿拉伯木聚糖與面筋蛋白競爭水分子，導致面筋水合不充分[31]。木聚糖酶處理對面團中面筋結構的影響并不明顯，但是較大纖維素片段數量顯著減少。從FBD和FXBD面團中可以觀察到明顯的片狀面筋蛋白，在其之間有粗細不同的面筋束相互交聯，幾乎看不到斷裂的面筋碎片和粗纖維片段。

面團發酵過程中，酵母產生大量的CO2充斥在面筋網絡中形成氣孔，這些氣孔多為中小尺寸且分布均勻[31]。如圖3所示，BD面團結構致密，幾乎沒有看到明顯的氣孔； XBD面團含有少量不規則孔隙，而FBD和FXBD面團中氣孔分布均勻且邊緣平滑。這都歸因于發酵麥麩中富含多種纖維素水解酶類促進纖維素溶解[15]，有利于酵母產氣及面團持氣。微觀結構分析顯示，馬克斯克魯維酵母發酵麥麩制作的面包面團中面筋網絡結構更加均勻、連續；面團產氣和持氣性能較好。

2.5 面包面團流變發酵特性及烘焙學特性

表面膠黏的面團對于現代工業化生產加工非常不利，這些面團不僅容易粘住加工設備而導致食品生產線受阻，還會造成產品質量下降和貨架期縮短[12]。攪拌后XBD面團中WEAX含量與FBD相當(表2)，但是前者表面更加膠黏。這可能與木聚糖酶的底物偏好性有關，Verjans等[29]研究認為外源木聚糖酶更傾向作用于可溶性木聚糖，生產較多的小分子木聚糖片段增加面團黏度。令人驚訝的是，FXBD面團表觀黏度與FBD面團相近，并未受到添加的木聚糖酶影響(表3)。

相比BD面團，FBD面團的吸水率降低了5.64%，形成時間和面團穩定時間分別增加了46.17%和44.85%。這是由于發酵麥麩中的天然酶(圖2)影響了麥麩中阿拉伯木聚糖的溶解性，進而改變了面團中水分子分布狀態。由表3可知，與BD相比，FBD和FEBD最大程度提升了面團的發酵高度(23.60%～26.73%)和持氣率(18.77%～18.91%)，且僅添加木聚糖酶對面團的發酵特性影響較小。這可能是發酵麥麩中的多種水解酶促進難溶性纖維素溶解，面筋網絡結構呈現出連續性；而僅添加木聚糖酶傾向作用于可溶性木聚糖，對面筋網絡影響較小，與面團微觀結構(圖3)和WEAX含量變化(表2)結果保持一致。

富含天然酶的發酵麥麩和木聚糖酶對面包比容的影響與面團發酵特性保持一致(表3)。正如微觀結構所示(圖3)，BD面團面筋斷裂且氣孔稀少，面包比容只有4.49 mL/g。相比BD面團面包，FBD和XBD面包比容分別提高了10.69%和2.90%，而FXBD面包提高了17.15%。除了面團膨脹體積，面包比容也受到面包水分含量(質量)的影響[32]。值得一提的是，FXBD面包芯硬度非常小，表明FXBD面包具有較柔軟的面包芯結構。這都歸因于馬克斯克魯維酵母發酵麥麩中麩皮內源酶，酵母代謝酶及添加的木聚糖酶活力[31]的影響。

圖3 馬克斯克魯維酵母發酵麥麩對面團微觀結構的影響Figure 3 Effects of fermented bran with Marx Kluyveromyces on microstructure of doughs.

表3 馬克斯克魯維酵母發酵麥麩對面包面團流變發酵特性和烘焙學特性的影響?Table 3 Effects of fermented bran with Marx Kluyveromyces on dough rheology, fermentation and baking characteristics

? 同一列數據中標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P≤0.05)。

3 結論

馬克斯克魯維酵母在麥麩基質中生長良好，發酵過程中可滴定酸含量(TTA)顯著增加，而pH值維持在6.0左右，使這些天然酶(纖維素酶、木聚糖酶和阿魏酸酯酶)在面包制作過程中保持活力；在面團醒發和焙烤初期可溶性糖和游離酚含量顯著增加，賦予面包較好的營養價值。掃描電鏡(SEM)觀察發現：相比僅添加木聚糖酶的麥麩面團，富含天然酶的發酵麥麩面團中面筋網絡結構更加均勻、連續，氣孔更加細膩光滑。與麥麩面包面團相比，添加發酵麥麩的面團穩定時間長、持氣率高且比容較大。值得關注的是，富含天然酶的發酵麥麩和木聚糖酶結合使面包比容進一步提高，且面包芯硬度顯著(P≤0.05)降低。馬克斯克魯維酵母在高膳食纖維面包體系中有良好的應用潛力。

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