Krüppel樣因子6對于TGF-β1誘導的晶狀體上皮細胞纖維化的調控作用研究

高美子 ，黃亮瑜 ，東莉潔 ，楊光 ，田芳

后發性白內障是白內障囊外摘除術后常見并發癥，是由術后殘留的晶狀體細胞增殖移行和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）等引起的晶狀體后囊膜混濁后囊膜混濁（posterior capsular opacification,PCO）[1]，是白內障術后視力下降的常見原因。近年來手術方案和人工晶狀體雖有改良，PCO的防止也隨之取得一些進展，但關于其發病機制尚不明確。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是一種能使正常的成纖維細胞的表型發生轉化，主要參與調節細胞的生長與分化的生長因子，在房水、玻璃體、晶狀體上皮細胞中均有表達，對晶狀體上皮細胞（lens epithelial cells,LECs）終末分化具有調節作用[2]。 TGF-β1通路也是參與和誘導EMT的重要途徑，是目前已知的參與誘導LECs發生EMT的重要細胞因子[3]。

Krüppel樣因子 6（Krüppel-like factor6,KLF6）是一種腫瘤抑制因子，多項研究證實[4]其在細胞發育、細胞分化、增生、凋亡、血管生成及組織修復等生理或病理過程中發揮重要作用，并在多種纖維化疾病機制的研究中發現KLF6與TGF-β1的表達，具有相關性和潛在聯系[5-7]。

鑒于KLF6在細胞纖維化中的重要作用，以及TGF-β1在晶狀體上皮細胞EMT過程中的調控作用。本次研究采用真核質粒轉染法，初步探討KLF6過表達對TGF-β1誘導的晶狀體上皮細胞纖維化的影響，從而為進一步探討后發障的發病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人晶狀體上皮細胞 （human lensepithelial cells,HLECs）細胞株（HLE-B3細胞）（由天津醫科大學眼科學院眼科研究所楊春波博士惠贈），pEGFP-C2-KLF6真核表達質粒由本實驗室自行構建，其制備的方法及有效性驗證等實驗內容已發表于《中華實驗眼科雜志》，轉染pSilencer-KLF6由本實驗室自行構建，TGF-β1購自美國peprotech（工作濃度0.5 ng/ml），Trizol試劑 （美國 Invitrogen公司），First Strand cDNA Synthesis Kit（美國 Thermo 公司），2xSYBRGreen Mix （瑞士 Roche 公司），DreamTaqTMHot Start DNA Polymerase，Transwell小 室 （ 美 國Coming公司），Lipofeetamine 2000 （美國 Invitrogen公司）。

1.2 細胞培養

使用含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640完全培養基，置于37℃，95%空氣，5%二氧化碳的密閉恒溫培養箱中培養。

1.3 轉染與檢測

檢測 pEGFP-C2-KLF6（KLF6）和 pSilencer-KLF6（siKLF6）轉染后HLECs中KLF6表達情況。接種每孔6×105個HLECs于1 ml培養體系的6孔細胞培養板中，待細胞匯合度達到70%左右，利用脂質體2000分別轉染空載體、KLF6和siKLF6至HLECs中。轉染48 h后，提取總RNA經反轉錄聚合酶鏈反應 （reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR）及實時定量PCR反應（real-time quantitative PCR,q-PCR）的方法分析KLF6的表達。

1.4 兩種PCR方法分析轉錄水平的基因表達

體外培養HLECs細胞：接種于6孔板，按實驗分組予相應的處理，37℃，5%CO2培養48 h后，進行總RNA提取。

按Trizol提取液說明書抽提細胞總RNA：首先4℃預冷離心機，同時新鮮配置體積分數75%乙醇溶液置于4℃備用。吸棄6孔板中的培基，用PBS洗2次，每次3 min，每個孔加入 1 ml的 Trizol，靜置 3～5 min，將細胞裂解液吸到1.5ml EP管中，加200μl氯仿輕搖15 s，待溶液混合成粉紅色，靜置15 min，4℃，Frc=12 000離心15 min，取上清至另一新EP管中，加入等量異丙醇，吹打混勻上下倒置數次，靜置10 min，4℃，Frc=12 000離心 15 min，棄上清，加入 1 ml已配好的體積分數75%乙醇，4℃，Frc=12 000離心5 min，棄上清后晾干，加入40μl DEPC水溶解并靜置20 min，渦旋后離心，超微量分光光度計檢測其濃度，A260/A280比值介于 1.8～2.0之間視為RNA提取質量良好，存于-80℃保存備用。

cDNA反轉錄：根據測得的RNA濃度，來計算1 μg RNA所對應的體積，加入到提前置于冰上的無菌無核酸酶的PCR管中，并按照順序依次加入下面的反應物，建立一個總量為12μl的體系，其中oligo（dT）加1μl，RNA為所算好的體積，最后用DEPC補足到12μl，放入RNA逆轉裝置65℃孵育5 min，冰上冷卻，離心收集，再置于冰上冷卻，依次加入4 μl reaction buffer，1 μl RNase inhibitor，1 μl transcriptase和 2μl dNTP 2μl，總體積為 20μl，輕輕混勻后離心，42℃孵育60 min，70℃加熱5 min終止反應，反應物可直接用于PCR反應。甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內參。

RT-PCR：引物選擇見表1，反應條件見表2，最后所得擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，于紫外透射儀下觀察結果。

表1 RT-PCR引物

表2 RT-PCR反應條件

q-PCR：引物選擇見表3。將2μl模板cDNA，2 μl上下游引物的等比混合物，4μl SYBR熒光染料，最終體積8μl，依次加入384孔板（避光冰上操作），每組3個復孔，實驗重復3次，放入Real-time PCR儀內反應，調整擴增參數為：50℃2 min孵育，95℃10 min變性，重復40次循環：95℃15 s變性、55℃30 s退火、72℃30 s延伸；最后加入解離階段（95℃15 s、60 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s）。根據擴增曲線，輸出 CT值，依照公式 2-ΔΔCt法進行數據分析。

表3 q-PCR引物

1.5 Transwell細胞遷移實驗

體外培養HLECs細胞，并分為3組：空載體對照組（只轉染空載體，無KLF6質粒，無TGF-β1刺激），單純 TGF-β1刺激組 （轉染空載體并予以TGF-β1刺激），KLF6高表達組 （轉染KLF6質粒并予以 TGF-β1）

接種于6孔板，按實驗分組予相應的處理，37℃，5%CO2培養 48 h后，取出 transwell板，先用1640培養液浸潤，下層加入600μl，上層加入100 μl，放在37℃培養箱中孵育1 h，在孵育1 h期間，用胰酶消化3組細胞，離心、計數各組細胞，用1%培養基將細胞配制成濃度為3×105/ml，每組設3個復孔，取出transwell板，棄除之前小室上1640培養液，入配制好的細胞懸浮液100μl，輕晃transwell板，放于培養箱中。提前配制好吉姆薩染液，以1 g的姬姆色素染料加入66 ml甘油，混勻，60℃保溫溶解2 h，再加入66 ml甲醇混勻，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS稀釋10倍左右就可以使用 （此為姬姆薩工作液）。根據需要量，配好工作液，此工作液常溫可保存2周。用真空泵小心吸取下室上清液和上室培養液，再用棉簽輕微擦拭小室基膜，以擦除基膜內壁細胞，然后在下室加入600μl 0.1%吉姆薩染液，染色25 min，用18.2Ω水清洗3遍，每次10 min，清洗完成后適度風干，用角膜刀將基膜環形切下，注意正反面，小室底面在上，放置在載玻片上，用玻璃棒蘸取中性樹膠一滴于基膜上，將蓋玻片從一側緩慢放于基膜上（盡量不產生氣泡）。

在光學顯微鏡下觀察基膜上的細胞，并分4個象限隨機視野下拍照，每個象限2張，采用直接計數法計數穿過基膜細胞數。重復試驗3次，統計數據，進行分析。

1.6 統計學方法

使用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析，GraphPad Prism7軟件對所獲得數據進行圖表整理。計量資料組間比較采用兩獨立樣本t檢驗 （2組數據）或單因素方差分析（3組數據）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達水平

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，KLF6組中的亮度高于空載體對照組（Vec組）（圖1A）；灰度分析結果顯示，KLF6組中KLF6表達水平顯著高于Vec組，且差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖 1B）。q-PCR顯示，KLF6組中的KLF6表達量顯著高于Vec組（圖 1C）。說明 pEGFP-C2-KLF6轉染可以提高HLECs中KLF6的表達水平。

2.2 pSilencer-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達水平

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，siKLF6組中KLF6的亮度低于Vec組（圖2A）；灰度分析結果顯示，siKLF6組中KLF6表達水平顯著低于Vec組中KLF6表達水平，且差異具有統計學意義 （P＜0.05）（圖2B）。q-PCR顯示，siKLF6組中KLF6的表達量顯著低于Vec組（圖2C）。說明pSilencer-KLF6轉染可以降低HLECs中KLF6的表達水平。

圖1 pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達情況及定量分析。1A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達情況（RT-PCR）；1B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；1C.pEGFP-C2-KLF6轉染后 HLECs中 KLF6表達情況 （q-PCR） Vec： 空載體對照組 KLF6：pEGFP-C2-KLF6轉染組 HLECs：人晶狀體上皮細胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖2 pSilencer-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達情況及定量分析。2A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pSilencer-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達情況 （RT-PCR）；2B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；2C.pSilencer-KLF6轉染后HLECs中KLF6表達情況（q-PCR） Vec：空載體對照組 siKLF6：pSilencer-KLF6轉染組 HLECs：人晶狀體上皮細胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.3 pEGFP-C2-KLF6轉染后 HLECs中E-cadherin表達水平

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，KLF6組中E-cadherin的亮度低于Vec組（圖3A）；灰度分析結果顯示，KLF6組中E-cadherin表達水平顯著低于Vec組中E-cadherin表達水平，且差異具有統計學意義 （P＜0.05）（圖 3B）。q-PCR 顯示，KLF6 組中E-cadherin的表達量顯著低于Vec組（圖3C）。說明pEGFP-C2-KLF6轉染致KLF6高表達后，HLECs中E-cadherin的表達降低。

2.4 pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中Vimentin表達水平

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，KLF6組中Vimentin表達的亮度高于Vec組（圖4A）；灰度分析結果顯示，KLF6組中Vimentin表達水平顯著高于Vec組中Vimentin表達水平，且差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖 4B）；q-PCR 顯示，KLF6 組中 Vimentin表 達 量 顯 著 高 于 Vec組 （圖4C）。 說 明pEGFP-C2-KLF6轉染致KLF6高表達后，HLECs中Vimentin的表達水平升高。

圖3 pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達情況及定量分析。3A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達情況 （RT-PCR）；3B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；3C.pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達情況（q-PCR） Vec：空載體對照組 KLF6：pEGFP-C2-KLF6轉染組 （KLF6高表達組） E-cadherin：上皮鈣黏素 HLECs：人晶狀體上皮細胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖4 pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中Vimentin表達情況及定量分析。4A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中Vimentin表達情況（RT-PCR）；4B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；4C.pEGFP-C2-KLF6轉染后HLECs中 Vimentin表達情況 （q-PCR） Vec： 空載體對照組 KLF6：pEGFP-C2-KLF6轉染組 （KLF6高表達組） Vimentin：波形蛋白 HLECs：人晶狀體上皮細胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖5 pSilencer-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達情況及定量分析。5A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pSilencer-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達情況 （RT-PCR）；5B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；5C.pSilencer-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達情況（q-PCR） Vec：空載體對照組 siKLF6：pSilencer-KLF6轉染組 （KLF6低表達組） E-cadherin：上皮鈣黏素 HLECs：人晶狀體上皮細胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.5 pSilencer-KLF6轉染后HLECs中E-cadherin表達水平

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，KLF6低表達組中E-cadherin的亮度高于Vec組（圖5A）；灰度分析結果顯示，siKLF6組中E-cadherin表達水平顯著高于Vec組中E-cadherin表達水平，且差異具有統計學意（P＜0.05）（圖 5B）。 q-PCR 顯示，KLF6 低表達組中E-cadherin的表達量顯著高于Vec組（圖5C）。說明pSilencer-KLF6轉染致KLF6低表達后，HLECs中E-cadherin的表達升高。

2.6 pSilencer-KLF6轉染后 HLECs中Vimentin表達水平

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，KLF6低表達組中Vimentin表達的亮度低于Vec組（圖6A）；灰度分析結果顯示，siKLF6組中Vimentin表達水平顯著低于Vec組中Vimentin表達水平，且差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖 6B）。q-PCR 顯示，KLF6 低表達組中Vimentin表達量顯著低于Vec組（圖1C）。說明pSilencer-KLF6轉染致KLF6低表達后，HLECs中Vimentin的表達水平降低。

2.7 Transwell細胞遷移實驗

結果見圖7。單純TGF-β1刺激組中細胞遷移水平高于空白對照組（P＜0.05），且KLF6高表達組中發生遷移的細胞數量高于單純TGF-β1刺激組 （P＜0.05），即在TGF-β1刺激下隨KLF6的表達量增加，發生遷移的細胞數量相應提高。

2.8 pEGFP-C2-KLF6轉染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中Vimentin表達情況及定量分析

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，在TGF-β1刺激條件下，Vimentin表達量隨KLF6表達量增加而提高（圖8A）；灰度分析結果顯示，在TGF-β1刺激下，KLF6高表達組中Vimentin表達水平顯著高于Vec組中Vimentin表達水平，且差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖8B）。q-PCR顯示，在TGF-β1刺激條件下，Vimentin表達量隨KLF6表達量增加而提高（圖8C）。說明加入TGF-β1刺激后，Vimentin表達量升高，隨著KLF6的高表達，Vimentin表達量進一步增加。

圖6 pSilencer-KLF6轉染后HLECs中Vimentin表達情況及定量分析。6A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pSilencer-KLF6轉染后HLECs中Vimentin表達情況 （RT-PCR）；6B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；6C.pSilencer-KLF6轉染后HLECs中Vimentin表達情況（q-PCR） Vec：空載體對照組siKLF6：pSilencer-KLF6轉染組（KLF6低表達組） Vimentin：波形蛋白 HLECs：人晶狀體上皮細胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖7 pEGFP-C2-KLF6轉染后在TGF-β1刺激下HLECs細胞遷移情況。7A.Transwell細胞遷移實驗觀察各組HLECs遷移情況；7B.HLECs發生遷移的細胞數量 Vec：空載體 TGF-β1：轉化生長因子-β1 KLF6：pEGFP-C2-KLF6轉染（KLF6高表達） HLECs：人晶狀體上皮細胞

2.9 pEGFP-C2-KLF6轉染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中E-Cadherin表達情況及定量分析

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，在TGF-β1刺激條件下E-Cadherin表達量隨KLF6表達量升高而降低（圖9A）；灰度分析結果顯示，在TGF-β1刺激下，KLF6高表達組中E-Cadherin表達水平顯著低于Vec組中E-Cadherin表達水平，且差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖 9B）。 q-PCR 顯示，在 TGF-β1 刺激條件下，E-Cadherin表達量隨KLF6表達量增加而降低（圖9C）。說明加入TGF-β1刺激后，E-Cadherin表達量降低，隨著KLF6的高表達，E-Cadherin表達量進一步減少。

3 討論

EMT是上皮細胞在特定的生理或者病理情況下發生的細胞形態改變，細胞間黏附性降低，并向連接疏松，遷移能力更高的間質組織轉化的過程[8]。EMT與多種類型的腫瘤侵襲密切相關[9、10]。在眼科領域中，EMT的發生可使晶狀體上皮細胞增殖，遷移而引起PCO。

參與誘導和調控EMT過程的因素有很多，其中以TGF-β1誘導LECs發生EMT為眾多研究者所熟知。研究顯示[3]，白內障術后，房水內部環境發生改變，細胞因子TGF-β1促進LECs由立方形的上皮細胞向伸長的成纖維細胞表行轉變，并抑制上皮標志蛋白E-cadherin的表達，LECs逐漸喪失黏附鏈接和縫隙鏈接，細胞骨架重組，細胞遷移性和運動增加，并獲得基質細胞的標志如波形蛋白Vimentin。LECs發生EMT可引起細胞外基質固縮，從而引起后囊膜褶皺引起PCO。

圖8 pEGFP-C2-KLF6轉染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中Vimentin表達情況及定量分析。8A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pEGFP-C2-KLF6轉染后，在TGF-β1刺激下HLECs中Vimentin表達情況（RT-PCR）；8B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；8C.pEGFP-C2-KLF6 轉染后，在 TGF-β1 刺激下，HLECs中 Vimentin 表達情況（q-PCR） Vec：空載體 TGF-β1：轉化生長因子-β1 KLF6：pEGFP-C2-KLF6轉染 （KLF6高表達） Vimentin：波形蛋白 HLECs：人晶狀體上皮細胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖9 pEGFP-C2-KLF6轉染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中E-Cadherin表達情況及定量分析。9A.瓊脂糖凝膠電泳顯示pSilencer-KLF6轉染后，在TGF-β1刺激下HLECs中E-Cadherin表達情況（RT-PCR）；9B.瓊脂糖凝膠電泳的灰度分析結果；9C.pSilencer-KLF6轉染后， 在TGF-β1刺激下，HLECs中 E-Cadherin表達情況 （q-PCR） Vec： 空載體TGF-β1：轉化生長因子-β1 KLF6：pEGFP-C2-KLF6轉染（KLF6高表達） E-cadherin：上皮鈣黏素 HLECs：人晶狀體上皮細胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

KLF6作為一種重要的腫瘤抑制基因，參與多種與TGF-β1傳導相關的細胞增殖，纖維化等過程[12]。E-cadherin是一種鈣離子依賴的細胞間黏附分子，屬于I型鈣黏蛋白，參與介導細胞間的同源黏附[13]。E-cadherin表達下調會導致同源細胞間黏附力下降，有利于腫瘤細胞脫離原發部位，向細胞外基質擴散。E-cadherin表達減少或缺失目前被認為是肺癌等惡性腫瘤中EMT現象的重要標志[14]。波形蛋白（vimentin）是細胞骨架蛋白之一，特異性的分布于間質細胞中，在上皮源性腫瘤中表達是發生EMT特征的表現，與細胞的生長分化狀態以及細胞游走遷移有關。

鑒于PCO的發病機制尚不明確，本次研究采用真核質粒轉染法將pEGFP-C2-KLF6（KLF6）和pSilencer-KLF6（siKLF6）分別轉染到 HLECs中，并加入TGF-β1對細胞進行刺激，在KLF6高表達與低表達的水平下利用PCR方法檢測EMT相關標記蛋白E-cadherin與Vimentin的表達水平，采用細胞遷移實驗觀察HLECs遷移能力的改變，以初步探討KLF6在由TGF-β1誘導的晶狀體上皮細胞纖維化過程中的調節作用。

本次研究結果顯示（圖 1，圖 2）經 RT-PCR與q-PCR檢測下我們成功建立了KLF6高表達與低表達的細胞模型。并發現當KLF6呈高表達時，HLECs中E-cadherin表達水平降低 （圖3），同時Vimentin表達水平升高（圖4）。當KLF6呈低表達時，HLECs中E-cadherin表達水平升高 （圖5），同時Vimentin表達水平降低（圖6）。同時，在TGF-β1刺激條件下（圖8）細胞中Vimentin表達水平升高，且隨著KLF6的高表達，Vimentin表達量進一步增加，并且在TGF-β1刺激條件下（圖 9），細胞中 E-cadherin表達水平降低，且隨著KLF6的高表達，E-Cadherin表達量進一步減少。由此可見，KLF6可以通過上調Vimentin高表達以及促進E-cadherin的低表達，進一步促進TGF-β1誘導的晶狀體上皮細胞纖維化過程，從而為后發障的發生奠定了基礎。

本次研究創新性體現在：我們首次報道KLF6蛋白對TGF-β1誘導的人晶狀體上皮細胞纖維化的促進作用。利用KLF6特性我們可以針對性的設計KLF6的小干擾RNA，特異性的下調HLECs中KLF6的表達，從而內源性提高人晶狀體上皮細胞的抗纖維化能力，進而抑制或延緩后發性白內障的發生發展。

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