高效液相色譜熒光法檢測血漿中硫醇物的方法學研究

班艷娜,甄乾娜,傅惠佳

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院生殖健康與不孕癥?？?重慶 400016;2.重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科,重慶 400016)

生物硫醇物如同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、半胱氨酸(cysteine,Cys) 和半胱氨酸甘氨酸(cysteinylglycine,CysGly)等廣泛分布于人體內的細胞和血漿中，可通過氧化還原反應在硫化物的生物轉換中發揮重要作用。研究發現，尿毒癥患者心血管疾病發病率比健康人高10～20倍[1]，游離型硫醇物和還原型硫醇物濃度升高是尿毒癥患者的主要危險因素[2-3]。BALD等[4]建立了反相高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法檢測血漿中硫醇物水平，該方法以硼氫化鈉為還原劑，用2-氯-1-甲基喹啉四氟化-2-氯-1-甲基喹啉衍生后進行檢測,缺點是衍生條件復雜、流動相操作繁瑣。SJOBERG等[5]以7-呋喃-4-磺酸銨鹽(7-fuorobenzofurazan-4-sulfonic acid ammonium salt，SBD-F)為衍生劑建立了HPLC熒光檢測法，該方法可同時測定GSH、Cys、Hcy、CysGly等氨基硫醇物，缺點是衍生時間較長，且衍生溫度較高，不便于臨床標本的檢測。故本研究擬建立一種新型快速的、可同時測血漿中Hcy、Cys和CysGly的總量及其游離型、還原型濃度的HPLC熒光法，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器Hcy、Cys、CysGly、GSH、N-1-苯基-馬來酰亞胺[N-(1-pyrenyl)maleimide,NPM]、三羧基乙基膦[tris-(2-carboxylethyl)-phosphine,TCEP]購自美國Sigma公司，乙腈、甲醇(色譜純)購自美國TEDIA公司，醋酸鈉、醋酸、磷酸等其他試劑均為國產分析純，實驗用水為Millipore凈化裝置(美國Millipore公司)純化所得；HPLC系統(購自美國安捷倫公司)由液相系統、真空脫氣系統(g1322a)、四元泵(g1311a)、手動進樣器(g1328)和熒光檢測器(g1321a)組成，數據采集和處理采用安捷倫化學工作站，HIMAC-cf15低溫臺式離心機(日立工機株式會社)。

1.2方法

1.2.1試劑配置用磷酸鹽緩沖液(25 mmol·L-1，pH 7.4)配置標準混合溶液，GSH、Cys、Hcy、CysGly濃度分別為12、250、10、30 mmol·L-1，分裝后于-20 ℃下保存備用。工作溶液用體積分數70%乙腈稀釋備用。稱取120 mg TCEP 溶于1 mL磷酸鹽緩沖液配制成質量濃度為100 g·L-1的溶液，置于4 ℃保存。取7.4 mg NPM溶于25 mL乙腈中，其濃度為1 mmol·L-1，于4 ℃下保存備用?；旌涎獫{是取5份正常人血漿作為基質備用。

1.2.2色譜條件采用HypersilC18色譜柱(250.0 mm×4.0 mm，5 μm)和安捷倫Hypersil ODS 預柱 (4 mm×4 mm,5 μm)，柱溫25 ℃；采用程序可變熒光檢測器確定最佳發射波長和最佳激發波長，檢測流速：0.5 mL·min-1，流動相A：15 mmol·L-1醋酸鈉水溶液，流動相B：在300 mL水中加入1 mL乙酸和 1 mL 磷酸，流動相C:乙腈。梯度洗脫程序為：0.0～1.0 min，B和C體積分數分別為30%和70%；1.0～12.5 min，A、B、C體積分數分別為15%、15%和70%，進樣量20 μL，檢測時間13 min。

1.2.3標本預處理硫醇物總量測定：取血漿樣品90 μL，加入10 μL TCEP (10 g·L-1)進行還原,(37.0 ± 0.3) ℃水浴10 min；在還原后的溶液中緩慢加入400 μL衍生劑NPM (1 mmol·L-1)溶液,同時漩渦振蕩混勻，室溫衍生15 min后加入10 μL體積分數30%乙酸,然后于4 ℃ 下13 000×g離心 10 min，取上清液20 μL進樣測定硫醇物總量。游離型硫醇物測定：采用Millipore YM-30 離心超濾管，2 000×g離心 20 min 獲取超濾液。取超濾液 90 μL，加入10 μL TCEP(1 g·L-1)進行還原，(37.0±0.3) ℃水浴10 min；然后再緩慢加入400 μL NPM(100 μmol·L-1)進行衍生，漩渦振蕩混勻,室溫衍生15 min后于4 ℃下 13 000×g離心10 min，取20 μL上清液進樣測定游離型硫醇物。還原型硫醇物測定：取超濾液100 μL直接加入400 μL NPM(50 μmol·L-1)，漩渦振蕩混勻,室溫衍生15 min后于4 ℃下 13 000×g離心10 min,取20 μL上清液進樣測定還原型硫醇物。

1.2.4標準曲線制備和檢測限配置系列標準溶液，再將10 μL標準溶液加入到90 μL混合血漿中，混合物濃度的測定按“1.2.3標本預處理”進行。以不同濃度的工作液加入到基質中后測得的峰面積減去基質的峰面積為縱坐標(y)，不同濃度的工作液為橫坐標(x)進行線性回歸，得到總量和游離型硫醇物標準曲線。還原型硫醇物用標準溶液稀釋成6個濃度，還原型Hcy濃度梯度為0.005、0.050、0.100、1.000、2.000和4.000 mmol·L-1；還原型GSH濃度梯度為0.1、0.5、2.0、4.0、8.0和 10.0 mmol·L-1；還原型Cys濃度梯度為1.5、5.0、10.0、20.0、30.0和50.0 mmol·L-1；還原型CysGly濃度梯度為0.2、1.0、3.0、6.0、12.0和30.0 mmol·L-1。以峰面積為縱坐標(y)，硫醇物的濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線。以3倍信噪比S/N=3時樣品濃度為最低檢測限。

1.2.5精密度試驗日內精密度試驗是在1 d內連續測定5次同一混合血漿Hcy、GSH、Cys、CysGly總量及其還原型和游離型濃度，計算5份樣本中4種硫醇物的濃度變異。日間精密度試驗是連續5 d測定同一混合血漿中Hcy、GSH、Cys、CysGly總量及其還原型和游離型濃度，計算5份樣本中這4種硫醇物的濃度變異。

1.2.6加樣回收率試驗取90 μL混合血漿，加入10 μL不同濃度的Hcy、GSH、Cys、CysGly標準溶液，測定加入標準溶液前后血漿硫醇物濃度。相對回收率=(血漿標準溶液濃度-未加標準液血漿濃度)/加入標準液濃度×100%。

1.2.7實例應用選擇2015年10～11月在重慶醫科大學附屬第一醫院血液透析中心進行血液透析的尿毒癥患者34例，其中男17例，女17例，年齡34～75(58.7±12.8)歲。選擇同期健康體檢者32例，其中男16例，女16例，年齡36～69(55.5±10.3)歲。采集所有受試者清晨空腹靜脈血，置于乙二胺四乙酸二鉀真空管內，立即置于冰上，1 h內3 000×g離心10 min分離血漿，分成2份，一份用于測定硫醇物總量，置于-20 ℃冰箱保存；另一份置于Millipore YM-30離心超慮管中2 000×g離心 20 min，用于測定游離型和還原型硫醇物。游離型與還原型硫醇物應立即衍生，并在 24 h 內測定。

2 結果

2.1波長的選擇通過Agilent LC-1100色譜化學工作站對NPM-GSH、NPM-Cys、NPM-Hcy和NPM-CysGly衍生物進行熒光光譜掃描，結果顯示，GSH、Cys、Hcy、CysGly最佳發射波長為380 nm;GSH的最佳激發波長為230 nm，其余3種硫醇物的最佳激發波長均為330 nm。綜合考慮選擇激發波長330 nm和發射波長380 nm作為檢測波長。

2.2色譜圖在本研究色譜條件下血漿中4種硫醇物之間能達到與基線分離，與內源性化合物及TCEP、NPM反應的峰分離良好，無干擾峰；見圖1。

A：總的硫醇物；B：游離型硫醇物；C：還原型硫醇物；D：硫醇物標準品混合溶液。

圖1硫醇物的色譜圖

圖1Chromatogramfortheaminothiols

2.3標準曲線和檢測限結果見表1?？偭考坝坞x型和還原型GSH、Cys、Hcy、CysGly的線性回歸方程相關系數均>0.99。GSH、Cys、Hcy及CysGly總量最低檢測限分別是1.0、3.0、0.5、1.5 μmol·L-1,還原型GSH、Cys、Hcy、CysGly最低檢測限分別是0.050、1.000、0.005、0.020 μmol·L-1。

表1GSH、Gys、Hcy、CysGly總量及其游離型和還原型濃度檢測的標準曲線和最低檢測限

Tab.1Standardcurvesandminimumdetectionlimitsoftotal,freeandreducedGSH,Cys,HcyandCysGly

檢測物質標準曲線相關系數線性范圍 /(μmol·L-1)最低檢測限/(μmol·L-1)GSHy=52.1x+37.30.999 02.00～80.001.000Cysy=62.6x+1 356.00.999 810.00～1 500.003.000Hcyy=121.9x-73.70.999 91.00～120.000.500CysGlyy=87.2x+179.00.999 53.00～240.001.500還原型GSHy=22.9x+1.50.999 30.10～8.000.050還原型Cysy=37.7x+11.00.999 61.30～50.001.000還原型Hcyy=152.1x-0.50.999 20.01～4.000.005還原型CysGlyy=144.7x-0.80.999 30.05～6.000.020

2.4精密度和回收率結果見表2。測得樣本回收率在80.1%～111.7%。日內精密度相對標準偏差(ralative standard deviation，RSD)均小于5%，日間精密度RSD均小于10%。

表2GSH、Cys、Hcy和CysGly的回收試驗和精密度

Tab.2RecoveriesandprecisionofGSH,Cys,HcyandCysGlyinplasma

檢測物質加入量/(μmol·L-1)精密度回收率/%RSD/%日內日間GSH4.03.81±0.0997.04.018.1310.09.12±1.0189.11.495.0720.021.06±1.07109.12.317.78Cys100.082.67±2.2380.21.314.41250.0264.10±2.17104.30.422.57500.0538.10±3.66109.21.714.76Hcy1.51.36±0.5988.14.868.0915.014.96±0.3599.03.764.1560.066.42±3.87115.24.484.98CysGly6.05.45±4.4395.44.225.7930.029.86±0.1099.34.154.4760.070.05±3.10115.14.514.37

2.5臨床應用結果見表3。該方法成功應用于34例尿毒癥患者和32例健康人血漿中GSH、Cys、Hcy和CysGly的總量及其游離型和還原型濃度的測定。

表3尿毒癥患者和健康人血漿中GSH、Cys、Hcy和CysGly總量、還原型和游離型的濃度

Tab.3Thetotal，freeandreducedconcentrationsofGSH,Cys,HcyandCysGlyinplasmaofurimicpatientsandheathypeople

檢測物質尿毒癥患者(n=34)健康者(n=32)GSH總量/(μmol·L-1)6.03±2.367.94±1.58游離型GSH/(μmol·L-1)2.11±1.485.92±1.18還原型GSH/(μmol·L-1)0.41±0.340.69±0.30Cys總量/(μmol·L-1)548.00±106.00221.00±49.00游離型Cys/(μmol·L-1)118.00±41.0042.00±12.00還原型Cys/(μmol·L-1)4.63±2.362.60±0.96Hcy總量/(μmol·L-1)36.80±15.3014.40±9.10游離型Hcy/(μmol·L-1)9.12±5.082.16±1.01還原型Hcy/(μmol·L-1)0.08±0.050.05±0.02CysGly總量/(μmol·L-1)31.30±10.5020.90±6.00游離型CysGly/(μmol·L-1)8.89±5.2210.52±3.44還原型CysGly/(μmol·L-1)0.12±0.060.07±0.04

3 討論

Hcy是蛋氨酸代謝的中間產物，是導致心血管疾病的危險因子，GSH、Cys、Hcy和CysGly是細胞還原能力的來源，在機體的生物代謝中起著重要的作用。當細胞功能受損時，GSH、Cys、Hcy和CysGly代謝會發生紊亂，生物體液中濃度會顯著改變，同時檢測這些硫醇物總的血漿濃度對疾病診斷、治療以及評估機體的氧化還原狀況具有重要意義[3-5]。

目前，測定血漿硫醇物的常見方法主要是HPLC[6-10],其中柱前衍生HPLC熒光檢測是檢測血漿中GSH、Cys、Hcy及CysGly總量最常用的方法。NOLIN等[8]以SBD-F為衍生劑同時測定了GSH、Cys、Hcy和CysGly的總量，其缺點是樣品預處理方法復雜，衍生時間為1 h，溫度60 ℃，不便于臨床標本的檢測。BENKOVA等[9]合成了一種新的衍生劑，僅用于測定血漿中GSH、Cys和Hcy的總量，該方法簡單、快速、靈敏度高，最低檢測限達1.2 pmol·L-1，但是色譜分離時易受大量的熒光雜質干擾。FERIN等[10]采用HPLC法同時測定了血漿中GSH、Cys、Hcy、CysGly的總量，該方法靈敏度高，最低檢測限為0.01 μmol·L-1，但是衍生溫度高達60 ℃，不宜臨床常規檢測。由于目前常用的檢測硫醇物方法衍生條件均存在衍生溫度高、時間長以及未能同時滿足總量、游離型和還原型硫醇物的精確定量等缺陷，本研究采用HPLC熒光檢測，以NPM為衍生劑，TCEP為還原劑，建立了一種簡單測定血漿中各種硫醇物的總量、游離型和還原型濃度的方法。

血漿硫醇物大多以蛋白復合物形式存在，所以測定血漿中各種形式的硫醇物需在樣品衍生前進行還原處理。TCEP作為還原劑，具有穩定、能溶于水、受反應時間、溫度和濃度影響小等優點，較采用其他還原劑重復性好，在4 ℃可穩定1周[11]，更適合臨床常規分析。NPM是巰基的特異性衍生劑，衍生反應在常溫10 min內即可完成，產生的熒光效率高且穩定，色譜圖背景干凈，色譜峰形良好，是一種理想的硫醇物熒光衍生劑[12]。該方法衍生條件簡單、快速，靈敏度高，最低檢測限達0.005 μmol·L-1，并成功運用于尿毒癥患者透析前及健康人血漿中硫醇物的檢測。

綜上所述，本研究將NPM作為衍生劑，利用HPLC-熒光法，建立了一種新的可同時測定血漿中GSH、Cys、Hcy和CysGly的總量及其還原型和游離型濃度的方法。該方法具有衍生條件簡單、衍生后靈敏度高的特點，并成功應用于尿毒癥患者和健康人血漿中硫醇物濃度的快速測定。

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