酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝提高酒精產量機理解析

王慧軍，楊新超,2，王柯，張建華，毛忠貴*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫, 214122) 2(濟南大學 生物科學與技術學院,山東 濟南，250022)

酒精是我國大宗發酵產品之一，2020年年產將達到1 000萬t[1]。但是廢水污染問題變得更加嚴重，已經成為限制酒精工業發展的重要因素。以木薯酒精生產工藝為例，其廢液處理工藝比較復雜，步驟多、投資大，運行和維護費用高，還需進入城市污水處理系統做深度處理。江南大學毛忠貴教授團隊于2006年提出的“酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝”詮釋了一條全新的解決思路[2-3]。在該工藝中(圖1)，木薯原料中的淀粉經過液化、糖化、發酵、蒸餾等技術手段轉化為成品酒精，而蒸餾過程產生的70%左右的廢水經過厭氧消化(沼氣發酵)轉化為生物質能源——沼氣，沼氣發酵后的沼液經過水資源化處理，達到資源化指標后與30%的酒糟(酒糟，主要成分為木薯原料中不能被酵母菌利用的纖維素、半纖維素、果膠等生物質，釀酒酵母代謝主要副產物，如小分子有機酸、甘油、異戊醇，以及雜菌產生的乙酸、乳酸、丙酸等)清液混合，回用作為工藝用水，實現廢水零排放目標；沼氣替代煤炭作為能源物質，通過“熱電聯產”技術獲得綠色能源，回供于生產中的各個工序。該工藝相較于傳統工藝具有顯著優勢：(1)削除了占地面積大、運行費用高的好氧消化處理；(2)消除了污水深度處理費用；(3)實現廢水回用，節約大量水資源；(4)原料利用率提高約2%；(5)可消除發酵過程外觀氮源(如尿素)的添加，進一步降低輔料成本。

經過分析發現，乙酸銨是混合水中主要的氮源物質。本研究通過比較乙酸銨與硫酸銨、氯化銨2種氮源物質對酒精發酵的影響，揭示了酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝對酒精發酵效果影響的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：湖北宜昌安琪酵母有限公司；木薯：吳江永祥酒精制造有限公司；耐高溫α-淀粉酶(100 000 U/mL)和糖化酶(10 000 U/mL)：無錫杰能科公司。

1.2 方法

1.2.1 種子培養基(g/L)

葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH自然，115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 液化液制備與酒精發酵

按1∶3(g∶mL)的比例將木薯粉(平均粒徑0.45 mm)與配料水混合，加入耐高溫α-淀粉酶(15 U/g木薯粉)。加熱料液至90 ℃，維持100 min。自然降溫到室溫，用去離子水彌補液化過程損失的水分。分裝至250 mL三角瓶中，滅菌(115 ℃，15 min)。降溫到室溫，在超凈臺添加糖化酶(150 U/g木薯粉)、種子培養基[φ(種子液)=10%]和氮源(含氮質量濃度400 mg/L)進行酒精發酵。在30 ℃培養箱中靜置。

1.2.3 上罐酒精發酵

分批發酵在工作體積為3 L的5 L罐發酵罐(Baoxing Corp，China)中進行。將約300 mL的預培養種子接種到2.7 L無菌發酵培養基中。培養期間通過pH電極(Mettler Toledo)檢測pH變化，發酵溫度30 ℃。接種后每隔2 h取樣檢測，間歇攪拌。首先，分別以乙酸銨和硫酸銨作為氮源，進行酒精發酵，發酵過程不調控pH；然后再以硫酸銨為氮源，調控發酵過程pH，使之與乙酸銨為氮源時pH變化趨勢一致。

1.2.4 分析方法

總糖測定：斐林試劑滴定法[4]。

酒精濃度測定：蒸餾法[5]。

甘油測定：HPLC法。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm，Hercules，CA)；RI檢測器(Shodex RI-101，Japan)和UV檢測器(Dionex，USA)；流動相為5 mmol/L H2SO4；柱溫65 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL。

酵母細胞數測定：血球板計數法。

采用SPSS Statistics 19(IBM，USA)進行方差分析(Fisher’s least significant difference，LSD)，當p<0.05時認為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 不同氮源對木薯酒精發酵效果的影響

在酒精發酵過程中，每產生1分子乙醇就伴隨著1分子CO2的產生，因此可以通過酒精發酵過程發酵體系的失重情況來直接反映酒精發酵速率，并且可間接反映酒精產率。從發酵失重曲線來看(圖2-a)，當以乙酸銨為氮源時，在39 h時，發酵體系失重不再增加，說明此時酒精發酵已結束；而以硫酸銨和氯化銨分別為氮源時，酒精發酵延遲到48 h才結束。這說明以乙酸銨為氮源的酒精發酵速率明顯高于以硫酸銨和氯化銨分別為氮源的酒精發酵。此外，以乙酸銨為氮源的酒精發酵的總失重也明顯高于以硫酸銨和氯化銨分別為氮源的酒精發酵，間接表明乙酸銨可以提高酒精發酵的酒精產率。此外，相較于硫酸銨和氯化銨(pH 3.6)，乙酸銨作為氮源時發酵結束后發酵液pH也維持在相對較高的水平(4.20)(圖2-b)。與此相反，當以乙酸銨為氮源時殘總糖濃度相對較低(圖2-d)。由于培養基中含有的木薯渣，酵母的干重很難測量，因此使用血細胞計數器來計數酵母細胞以評估釀酒酵母的生長。圖2-c的結果表明當使用乙酸銨作為氮源時，獲得較低的生物量，這與高發酵率是由于高生物量產生的這一理論相悖[6]。

如圖3-a所示，乙酸銨為氮源時的酒精體積分數比硫酸銨和氯化銨為氮源時的酒精體積分數高4%左右，該結果與總失重結果相一致。不同氮源還會影響酒精發酵過程的最主要副產物甘油的產生。圖3-b顯示，以硫酸銨和氯化銨為氮源的酒精發酵的甘油產量相似，但比以乙酸銨為氮源的酒精發酵的甘油產量高約24%。

圖3 不同氮源對酒精發酵過程酒精產量(a)和甘油產量(b)的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on ethanol production (a) and glycerol production (b) in ethanol fermentation

根據上述結果初步推測，相較于硫酸銨和氯化銨，乙酸銨通過降低副產物甘油的合成以及發酵殘總糖的濃度，使得發酵體系中更多的碳源轉化為主產物酒精。那么，乙酸銨是如何降低甘油的合成以及殘總糖的濃度則是需要進一步解決的關鍵科學問題。酒精發酵過程中，酵母產生甘油的目的是用于維持胞內的氧化還原平衡和滲透壓平衡，此外當釀酒酵母所處培養基的pH發生變化時，也會影響釀酒酵母對甘油的合成。當氨氮作為氮源時，酵母利用氨氮合成氨基酸，同時生成NADH。為了避免胞內的NAD+/NADH比例失衡，釀酒酵母必須通過甘油產生途徑將NADH重新氧化為NAD+[7]。但是，實驗所用3種氮源同為銨鹽，且濃度相當，所以推測pH是造成2類氮源下甘油合成差異的主要原因。

為了證明這一推測，首先分別監測了乙酸銨、硫酸銨為氮源時，酒精發酵過程pH的變化情況，在此基礎上調節硫酸銨為氮源時發酵體系pH，使之與乙酸銨為氮源時pH變化趨勢一致，比較兩種條件下，酒精發酵效果。如圖4-a所示，當硫酸銨作為氮源時，發酵過程pH的下降速度和幅度明顯高于以乙酸銨為氮源時的發酵，發酵10 h時pH就下降到最低值pH 3.28，而對于乙酸銨，發酵18 h pH下降到最低值pH 3.94。在酒精發酵過程，發酵液pH的下降主要是由釀酒酵母通過營養傳遞過程分泌質子、吸收不同的離子、生成CO2和有機酸等過程引起的[8]。當銨鹽作為氮源時，釀酒酵母通過等離子膜ATPase產生的電化學等離子膜電勢將氨氮從培養基中吸收至胞內，細胞為了保持胞內pH穩定必須將等摩爾質子排至胞外，這就造成發酵液pH的下降[9-10]。硫酸銨和乙酸銨同為銨鹽，但是硫酸根為強酸鹽，而乙酸根為弱酸鹽，發酵過程乙酸鹽會與乙酸構成緩沖體系，在乙酸的pKa(4.75)附近產生較強的緩沖作用，致使發酵液pH下降速度和幅度相對較低，而發酵培養基中相對高的pH有利于糖化酶發揮作用，使得殘總糖的濃度較低。然而，以硫酸銨為氮源時，即使調節發酵體系pH使之與乙酸銨為氮源時pH變化趨勢一致，酒精發酵過程甘油產量不僅沒有下降，反而有所升高(圖4-b)。這說明硫酸銨為氮源時甘油產量較乙酸銨為氮源時低的現象并不是由較低的發酵pH所引起。

圖4 乙酸銨和硫酸銨為氮源時酒精發酵過程pH變化情況(a)、原始pH和調節pH條件下硫酸銨對甘油產量影響(b)Fig.4 Evolutions of pH throughout the ethanol fermentation with the ammonium acetate and ammonium sulfate as nitrogen source (a) and effects of ammonium sulfate on glycerol production under original pH and adjusted pH (b)

2.2 乙酸銨中乙酸根對酒精發酵的影響

乙酸銨所帶乙酸根除了對酒精發酵過程pH的變化趨勢產生影響外，可能也是影響釀酒酵母甘油合成的因素。因此，研究了不同氮源條件下，乙酸添加對于酒精發酵過程的影響。結果顯示，當以硫酸銨為氮源時，酒精發酵速率相對較低；而在此基礎上添加乙酸則可提高酒精發酵速率(相對于前者發酵時間縮短了約20.83%)并且與乙酸銨為氮源時的發酵速率相當。硫酸銨為氮源時，添加乙酸還會提高發酵結束時pH，進而導致發酵殘總糖較硫酸銨為唯一氮源時偏低，但是仍高于以乙酸銨為氮源的酒精發酵，這與上文所述殘總糖與發酵pH密切相關的結論一致。另外，向以硫酸銨為氮源的發酵體系中添加乙酸，可顯著提高酒精產量并降低甘油產量，并且與以乙酸銨為氮源時的發酵水平相當。上述結果說明，向發酵液中添加乙酸可以提高釀酒酵母酒精發酵效果，與硫酸銨和氯化銨相比，乙酸銨作為氮源對酒精發酵的正面影響主要是原因在于乙酸銨中乙酸根的存在。

圖5 不同氮源對酒精發酵過程失重(a)、發酵結束pH(b)和殘總糖(c)的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on weight loss (a),final pH (b) and residual total sugar (c) in ethanol fermentation

圖6 不同氮源對酒精發酵過程酒精產量(a)和甘油產量(b)的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on ethanol production (a) and glycerol production (b) in ethanol fermentation

圍繞乙酸對釀酒酵母的影響及釀酒酵母對乙酸的響應機制，國內外學者開展了大量的研究工作，主要得到了如下結論或推論：(1)低pH(

3 結論

酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝的應用不僅可為酒精發酵提供足夠的氮源，還可提高酒精產率，降低副產物甘油的生成。本文研究表明，回用水中乙酸銨是一種有效的酒精發酵氮源物質，相較于硫酸銨和氯化銨，它可縮短酒精發酵時間、提高酒精產率及減少副產物甘油合成。因此，乙酸銨是造成酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝對酒精發酵效果產生正面影響的主要因素。

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