酸性環境抑制高磷誘導大鼠VSMCs鈣化的機制研究*

耿同會，徐金升，韓迎迎，白亞玲，張俊霞，崔立文，張勝雷

（河北醫科大學第四醫院 腎內科，河北 石家莊 050011）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）患者心血管疾病發病率是普通人群的10～30倍[1]，血管鈣化為主要危險因素[2]。血管鈣化是細胞介導的生物礦化過程[3]，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）表型轉化是其重要機制[4]。代謝性酸中毒是CKD患者常見的并發癥。研究發現，酸性環境可抑制大鼠血管鈣化，但具體機制尚不明確[5]?；罨疶細胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT）是一種有多種調控作用的轉錄因子，GOETTSCH等[6]發現，NFATc1對血管鈣化有促進作用。因此筆者推測，酸性環境可能通過下調NFATc1表達，抑制血管鈣化。本實驗以大鼠VSMCs為研究對象，旨在探討酸性環境對高磷誘導大鼠VSMCs鈣化的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6只4周齡健康雄性SD大鼠，原代培養大鼠胸主動脈平滑肌細胞，大鼠購自河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證標號：1305090。

1.1.2 主要儀器和試劑 倒置相差顯微鏡（LH50A型）（日本Olympus公司），CYTATION3型酶標儀（美國Biotek公司），胎牛血清﹑細胞培養基購自美國Gibco公司，β－甘油磷酸（美國Sigma公司），酸度計（北京賽多利斯科學儀器有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性試劑盒（南京建成生物工程研究所），鈣含量測定試劑盒（北京中生北控生物科技股份有限公司），RNA提取試劑盒﹑RNA逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司），PCR引物（上海英濰捷基公司），NFATc1﹑Runt相關轉錄因子2（runt related transcription factor 2, Runx2）抗體購自英國Abcam公司，GAPDH抗體（美國Bioworld公司）。

1.2 方法

1.2.1 鈣化VSMCs的制備及分組 取4周齡健康雄性SD大鼠的胸主動脈，采用組織塊貼壁法培養原代VSMCs，實驗取3～5代細胞。采用隨機數字表法，將VSMCs隨機分為正常對照組﹑高磷＋pH 7.4組﹑高磷＋pH 7.1組。正常對照組用含10%胎牛血清培養基培養，調整pH值至7.4；高磷＋pH 7.4組在10%胎牛血清培養基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸，調整pH值至7.4；高磷＋pH 7.1組用高磷培養基，調整pH值至7.1。使用1 mol/L鹽酸HCl和7.4%碳酸氫鈉調整培養基pH值，換液1次/24 h。

1.2.2 細胞鈣含量測定 將24孔板內培養的細胞干預14 d后，棄上清液，用1 mmol/L HCl消化過夜，取上清，使用鄰甲酚酞絡合酮比色法測定鈣含量；細胞用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液和0.1%十二烷基硫酸鈉溶解30min，根據吸光度值計算細胞蛋白含量。VSMCs的鈣含量結果用細胞鈣含量與蛋白含量的比值表示（mg/g）。

1.2.3 茜素紅染色 取4～5代細胞以5×104個/孔密度接種于24孔板內，干預14 d。用pH 8.4濃度為0.1%的茜素紅染液進行鈣化染色，倒置顯微鏡下觀察照相。結果判斷標準：鈣鹽沉積為橘紅色。

1.2.4 ALP活性測定 將細胞培養14 d后棄上清，磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，加入1%聚乙二醇辛基苯基醚生理鹽水，置于4℃冷藏24 h后離心，取上清液，按ALP活性試劑盒說明書操作，測定其活性，結果用蛋白質校準。

1.2.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR） RT-PCR檢測VSMCs目的基因的表達。干預4 d后提取各組細胞mRNA，測定NFATc1和Runx2基因的表達。PCR引物由Primer 5.0軟件設計，引物序列見表1。PCR反應體系為20μl，NFATc1反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32個循環；GAPDH反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32個循環；Runx2反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共28個循環，72℃繼續延伸10min。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測 Western blot檢測VSMCs目的蛋白的表達。干預4 d后提取各組細胞蛋白，測定NFATc1和Runx2蛋白的表達。細胞蛋白質用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜﹑封閉，加入一抗稀釋液（NFATc1 1∶1 000，Runx2 1∶500，GAPDH 1∶5 000），4℃孵育過夜。洗膜，放入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫下孵育1 h，定影顯色，分析條帶灰度值。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗；相關性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酸性環境對高磷誘導VSMCs鈣化的影響

干預14 d后，正常對照組﹑高磷＋pH 7.4組﹑高磷＋pH 7.1組VSMCs的鈣含量分別為（47.423±10.515）﹑（119.306±13.443） 和（89.738±12.542）mg/g，經方差分析，差異有統計學意義（F=22.138，P=0.0017）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。高磷環境下大鼠VSMCs鈣含量水平升高；pH值降低時VSMCs鈣含量減少。

與鈣含量結果類似，茜素紅染色可見正常對照組VSMCs無橘紅色鈣鹽結節出現，高磷組有大量橘紅色鈣鹽沉積，而酸干預可使鈣鹽沉積減少。見圖1。

2.2 酸性環境對高磷誘導VSMCs表型轉化的影響

正常對照組﹑高磷＋pH 7.4組﹑高磷＋pH 7.1組VSMCs的ALP活性分別為（32.510±2.393）﹑（106.206±4.294）和（85.715±6.227）u/g，經方差分析，差異有統計學意義（F=40.909，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。高磷＋pH 7.4組ALP活性高于正常對照組；酸干預后ALP活性降低。

正常對照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的Runx2 mRNA相對表達量分別為（0.213±0.008）﹑（0.317±0.054）和（0.562±0.070），經方差分析，差異有統計學意義（F=36.924，P=0.000）。正常對照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的Runx2 蛋白相對表達量分別為（0.390±0.108）﹑（0.785±0.069）和（1.095±0.121），經方差分析，差異有統計學意義（F=36.408，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，正常對照組﹑高磷＋pH 7.1組Runx2 mRNA和蛋白表達水平較高磷＋pH 7.4組低（P＜0.05），表明酸性環境可下調Runx2表達。見圖2。

2.3 酸性環境對高磷誘導的VSMCs中NFATc1表達的影響

正常對照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的NFATc1 mRNA相對表達量分別為（0.264±0.043）﹑（0.419±0.073 ）和（0.668±0.097），經方差分析，差異有統計學意義（F=22.512，P=0.002）。正常對照組﹑高磷+pH 7.1組﹑高磷+pH 7.4組VSMCs的NFATc1蛋白相對表達量分別為（0.155±0.066）﹑（0.362±0.031）和（0.661±0.096），經方差分析，差異有統計學意義（F=36.408，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，正常對照組﹑高磷＋pH 7.1組NFATc1 mRNA和蛋白表達水平較高磷＋pH 7.4組低（P＜0.05），高磷環境NFATc1表達升高。見圖3。

2.4 NFATc1與Runx2、ALP的相關性

VSMCs中NFATc1與Runx2表達呈正相關（r=0.801，P=0.003），NFATc1與ALP活性呈正相關（r=0.698，P=0.002）。

圖1 各組大鼠VSMCs鈣鹽沉積 （茜素紅染色）

圖2 各組大鼠VSMCs的Runx2 mRNA和蛋白的表達

圖3 各組大鼠VSMCs的NFATc1 mRNA和蛋白的表達

3 討論

代謝性酸中毒是CKD患者的常見并發癥。近期研究發現，代謝性酸中毒可以抑制VSMCs表型轉化[4]。近年來就酸性環境對骨形成的作用研究較為深入，然而其對血管鈣化的作用研究甚少，僅證實VSMCs成骨/成軟骨表型轉化是其重要機制之一[7]，因此，可將酸性環境對成骨作用的影響推演到血管鈣化上。血管鈣化是CKD患者發生心血管疾病的重要危險因素，不同于普通人群發生的動脈粥樣硬化，CKD患者以血管中膜鈣化為突出表現[8]。VSMCs作為血管中膜的重要成分，在血管鈣化發生過程中起重要作用。本實驗通過體外培養VSMCs，深入探討酸性環境對VSMCs鈣化的影響，發現與正常對照組相比，高磷刺激加重VSMCs鈣化，酸刺激可抑制高磷誘導的VSMCs鈣化。

血管鈣化是多因素共同參與的復雜病理過程，其發病機制尚未完全清楚。血管鈣化常常伴隨Runx2和ALP等成骨相關蛋白的表達[7]。Runx2是Runt結構域基因家族一員，可結合成骨細胞特異性順式作用元件，調控下游骨基質和骨膠原的產生，參與成骨細胞分化[7]。ALP亦是成骨細胞形成的早期標志物。兩者在正常VSMCs中表達較低，在鈣化的血管和心臟瓣膜組織中表達升高[9]。因此，可以憑借VSMCs中Runx2的表達量和ALP活性推測其是否發生成骨樣表型轉化。本研究結果顯示，與高磷＋pH 7.4組相比，高磷+pH 7.1組VSMCs的Runx2表達和ALP活性降低，提示高酸性環境抑制VSMCs鈣化的機制可能是抑制VSMCs發生成骨樣表型轉化。

NFAT最初在T細胞中因其免疫調控作用被發現，之后發現除免疫系統外，NFAT轉錄因子在其他組織也有廣泛分布，如心肌﹑骨骼肌﹑卵巢等組織，具有多種生理功能，如參與刺激T細胞活化﹑成骨細胞分化和成骨作用﹑破骨細胞分化，調控內皮細胞及VSMCs增殖[10]。NFAT家族蛋白活性主要由Ca2+/鈣調神經磷酸酶（Calcineurin, CaN）調節。當Ca2+﹑鈣調節蛋白與CaN結合后誘發CaN構象改變，使自身抑制域移位，暴露出活性位點，導致CaN活化，繼而使細胞漿中NFAT脫磷酸化，暴露其核定位信號，NFAT得以轉位入核，與核內其他轉錄因子協同調節多種基因的活化[11]。研究表明，在VSMCs中，NFATcl高表達，NFATc3少量表達，而NFATc2和NFATc4幾乎不表達[12]。有研究發現，在氧化低密度脂蛋白誘導VSMC鈣化過程中，NFAT發揮重要作用，敲除NFAT基因能抑制Runx2表達和基質礦化[6]。以上研究表明，NFATc1在血管鈣化中發揮重要作用，因此筆者推測NFATc1可能參與酸抑制VSMCs鈣化的過程。本研究從體外實驗觀察VSMCs中NFATc1的表達，結果發現高磷＋pH 7.4組VSMCs中NFATc1表達高于正常對照組，提示NFATc1參與慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的發生，可能對其有促進作用；進一步比較發現，酸性環境能夠抑制VSMCs中NFATc1 mRNA和蛋白的表達，由此推測NFATc1可能是酸抑制VSMCs鈣化發生的因素之一。

NFATc1在酸抑制高磷誘導的VSMCs鈣化中如何發揮作用？本研究就VSMCs中NFATc1蛋白表達水平與表型轉化指標（ALP活性和Runx2蛋白表達水平）做相關性分析，結果發現NFATc1與Runx2蛋白表達﹑ALP活性呈正相關。因此，筆者推測酸抑制VSMCs發生鈣化的可能機制是通過降低NFATc1表達，抑制VSMCs發生表型轉化來實現的。

綜上所述，本研究通過體外研究發現，酸性環境可以抑制高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化，其可能機制是通過降低NFATc1表達，抑制VSMCs發生表型轉化來實現的。但本研究僅從實驗室內觀察到NFATc1在酸抑制血管鈣化中的作用，具體機制仍需進一步實驗研究，以期為臨床預防和治療CKD患者的血管鈣化提供新靶點。

參 考 文 獻：

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