土霉素降解菌篩選及降解特性研究

孟應宏，馮 瑤，黎曉峰，劉元望，李兆君*

（1 廣西大學農學院，南寧 530004；2 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/農業部植物營養與肥料重點實驗室，北京 100081）

近年來，抗生素在畜禽及水產養殖中的過量使用，導致環境中耐藥菌的產生和食品中藥物的殘留，已引起社會各界廣泛關注[1–3]。我國是抗生素生產和使用大國，每年抗生素生產量達21萬噸，使用量達18.9萬噸，其中獸用抗生素占到一半以上[4]，主要應用于畜禽養殖中的抗生素主要有四環素類、青霉素類、大環內酯類等，其中，四環素類抗生素 (土霉素、四環素、金霉素等) 由于其具有質優價廉、廣譜性的特點，因而在畜禽養殖中被廣泛使用[5–7]。長期以來，抗生素的廣泛使用，取得了良好的效果。然而，濫用抗生素逐漸成為人們關注的熱點問題[8–9]。據報道，進入動物體內的抗生素約有60%～90%會隨著糞便、尿液等排泄物排出[10]，進而作為有機肥施入農田，這會對土壤、水體等環境產生不利影響。土壤中土霉素的主要來源為含有土霉素的畜禽糞便、污泥和廢棄物[11]。有研究表明，我國土壤、水產養殖場沉積物中可檢測到的土霉素含量高達200 mg/kg[12]、285 mg/kg[1]。因此，開展殘留土霉素的高效降解等研究很有必要。

環境中殘留抗生素的處理方法大致分為物理、化學和生物降解三種，其中，生物降解具有成本低廉、方法簡單、微生物處理高效、環境修復好等優點[13–14]，是治理環境污染的有效手段。微生物作為生物降解的主體[15]，對抗生素殘留的降解起關鍵作用。對于抗生素的微生物降解，主要是具有降解功能的抗生素的耐藥菌，因為這些耐藥菌能夠產生相應的降解酶，這些酶類進一步通過修飾或水解作用破壞抗生素的分子結構而導致抗生素降解[16]。目前已有一些和抗生素降解菌相關的研究，例如，碳角菌屬(Xylaria digitata) 能通過使碳核結構中間的兩個環裂開從而降解四環素，最終導致四環素失效[17]，土壤中分離到能夠高效降解泰樂菌素的無丙二酸檸檬酸桿菌[18]，豬糞中四環素類抗生素在土壤中能隨微生物降解等作用而逐漸減少[19]，生產四環素的藥渣中存在可降解四環素的酵母菌[20]，還有研究表明，在堆肥中添加外源菌劑可以有效去除四環素類抗生素的殘留[21]。對于土霉素降解菌的研究也有所報道，例如，從某土霉素生產廠污水池底泥中分離出一株以土霉素為唯一碳源的菌株[22]，從堆肥體系中分離到一株以土霉素為唯一碳源的降解菌[23]?？傮w來說，相關的研究還較少，自然界中大部分的微生物并不具有降解土霉素的能力，有研究表明，褐土和紅壤中的土著微生物對四環素和土霉素的降解均無顯著影響[24]，因此，對于土霉素降解菌的篩選需要更深入地研究。本研究旨在從污泥、藥渣和畜禽糞便中分離獲得土霉素的降解菌，并研究其降解特性，為今后發展高效降解土霉素的環保工程菌制劑并建立固定化微生物技術奠定基礎，并可減少土霉素在環境中的殘留，保障人和動物的健康。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

試驗樣品為菌肥、藥渣、畜禽糞便；土霉素(Oxytetracycline，OTC) 標準品購自德國 Dr.Ehrenstorfer公司，其結構式見圖1；甲醇、乙腈、正己烷 (色譜純) 購自美國Fisher公司；磷酸為優級純試劑；試驗用水為娃哈哈純凈水；EDTAMcIlvaine緩沖液。豬糞、鋸末、小麥秸稈的基本理化性質見表1。

圖 1 土霉素的分子結構式Fig. 1 Molecular structure of oxytetracycline

表 1 堆肥原料性質Table 1 Properties of selected compost materials

土霉素標準儲備液及標準溶液：準確稱取土霉素標準品0.050 g，加入少量甲醇溶解，然后轉移到10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成5 mg/mL的標準儲備液。標準溶液 (3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L) 均由儲存標樣加甲醇稀釋配制而成。標準儲備液和標準溶液保存在4 ℃冰箱內。

1.2 培養基制作

牛肉膏蛋白胨培養基：用牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 18 g、蒸餾水定容至 1000 mL，用1 mol/L氫氧化鈉調節pH至7.0～7.2后滅菌；

無機鹽培養基：氯化銨1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、磷酸氫二鉀 1.5 g、硫酸鎂 0.2 g、氯化鈉 1 g、瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，調節pH至7.0，高壓滅菌；

篩選培養基：在滅菌液體無機鹽培養基中加入土霉素母液。

1.3 土霉素降解菌的篩選

1.3.1 菌株的分離與純化 稱取 10 g 采集到的樣品于90 mL 滅菌蒸餾水的三角瓶中 (250 mL，內含玻璃珠)，置于搖床中 30℃、200 rpm 振蕩 30 min，取出后靜置。吸取100 μL上清液，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，置于30℃條件下培養2 d。將得到的菌落，在牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上劃線，依據菌落形態進一步分離和純化，重復多次，直至得到單一菌落；然后將單菌落分別接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃、180 rpm下遮光震蕩培養2 d，得到含有單一菌落的培養液。

1.3.2 菌株降解功能驗證 取 100 μL 上述培養液上清液，分別涂布于以土霉素為唯一碳源且土霉素濃度為25 mg/L的土霉素無機鹽固體培養基平板上，30℃遮光培養2 d，按25 mg/L的梯度逐漸提高培養基中土霉素的濃度至100 mg/L，培養同上。經馴化最終得到生長快、菌落規則、耐高濃度土霉素的菌株，初步認定為對土霉素具有降解能力的優勢菌株。劃線培養，于4℃冰箱內保存。

將分離得到的菌株分別轉接到牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行活化，然后將活化的菌液按1%的接種量轉接到以土霉素為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，30℃、180 rpm振蕩條件下遮光培養7 d，最后用高效液相色譜法測定各菌株對土霉素的降解率。試管斜面保存土霉素降解率高的菌株，于4℃冰箱內保存。

1.3.3 生長曲線的測定 降解菌株接種于 100 mg/L 土霉素的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃、180 rpm條件下培養，于不同時間取樣，采用分光光度法檢測樣品的OD600值，以確定降解菌的生長量。

1.3.4 土霉素含量的測定 采用 Alliance 2695 型高效液相色譜儀2998型PDA檢測器 (美國Waters公司)對土霉素含量進行測定。取培養液1 mL，加入5 mL甲醇，搖勻，10000 rpm離心15 min，取上清液，用0.22 μm針筒式微孔濾膜過濾得到濾液，待測。色譜條件為：色譜柱 Sunfire C18(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm，Waters，USA)，流動相為0.05%磷酸水溶液(A) 和乙腈 (B)，流速為 1.0 mL/min，柱溫 35℃，進樣體積20 μL，檢測波長為355 nm。洗脫程序為：0～17 min，93.2% A，6.8% B。根據線性回歸方程計算出土霉素的含量，并采用以下公式計算降解率：

降解率=(對照樣殘量–實樣殘量)/對照樣殘量 ×100%

1.3.5 菌株降解條件優化 選擇溫度、pH、轉速、接種量為研究對象，將降解菌株培養活化后接入到100 mg/L的土霉素培養基中，裝液量均為100 mL，在不同培養條件下培養7 d，測定土霉素降解率。每個處理設置三個重復，并設空白對照。

1) 溫度：調節pH為7，接種量為1%，設置20、25、30、35、40、45℃ 6 個溫度梯度，180 rpm搖床培養 7 d。

2) pH：調節 pH 分別為 3、4、5、6、7、8、9、10，接種量為 1%，30℃，180 rpm 搖床培養 7 d。

3) 轉速：調節pH為7，接種量為1%，設置110、130、150、170、190、210 rpm 6 個不同轉速，30℃ 搖床培養 7 d。

4) 接種量：調節pH為7，接種量分別為1%、2.5%、5%、10%，30℃，180 rpm 搖床培養 7 d。

1.4 土霉素降解菌堆肥試驗

共設置3個處理，具體為：1) 不加入土霉素，不加入T4菌株 (CK)；2) 加入土霉素，不加入T4菌株 (OTC)；3) 加入土霉素，加入菌株 T4 (OTC + T4)。各處理碳氮比均為 25，接種量為 1 × 109cfu/kg，含水率均為60%，土霉素的濃度為50 mg/kg，每個處理設置3次重復。把豬糞、鋸末和小麥秸稈進行攪拌，將土霉素溶液和液體T4菌種均勻灑到其中，室溫條件下發酵。第1、3、5、7、14、21、28、35、45 d取樣，裝于自封袋，在–20℃保存以備分析。用固相萃取進行提取，分析其中的土霉素含量。

數據分析、圖表繪制采用Excel和Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 土霉素降解菌株的篩選

經馴化、分離獲得10株耐土霉素的菌株，編號分別為 T1、T2、T3、T4、DX-1、DX-2、DX-3、ZC-1、ZC-2、ZC-3，其中 T1、T2、T3、T4 來源于菌肥，DX-1、DX-2、DX-3來源于畜禽糞便，ZC-1、ZC-2、ZC-3來源于藥渣。各菌株在以土霉素為唯一碳源的無機鹽培養基中生長情況見表2。其中T4菌的生長情況最好，因此，選取T4菌作為進一步研究的對象。

表 2 微生物菌落的生長狀況Table 2 Growth condition of microbial colony

2.2 降解菌株的鑒定

T4菌的16S rDNA基因測序所得序列提交NCBI后，通過BLAST程序與GenBank中核酸數據進行對比性分析。結果發現，T4菌與Pseudomonas sp.高度相似，在分子系統發育分類學上屬于假單胞菌，挑選相似度相近序列用MEGA 6.0按鄰接法構建系統發育樹，得到 T4 16S rDNA 基因系統發育樹 (圖 2)。

2.3 生長曲線的測定

采用分光光度法對T4降解菌的生長曲線進行測定。由菌液光密度值 (OD600)(圖 3) 可見，0～6 h 為T4菌的生長遲緩期，在6～32 h內菌株生產達到對數期，菌株個數呈對數增長，32 h之后菌體生長進入穩定期，菌數趨于飽和。

2.4 培養條件對土霉素降解效果的影響

2.4.1 溫度對菌株降解土霉素效果的影響 將 T4 菌接種于篩選培養基中，在不同的溫度下遮光振蕩培養7 d。由圖4可知，T4菌對土霉素的降解率隨溫度的升高先增加后減小。20℃時降解率為17.29%，隨著溫度的上升，土霉素降解率逐漸升高，30℃時降解率最高，達到了26.75%，之后降解率隨著溫度的升高而下降，45℃時降解率下降到16.38%。因此適宜的培養溫度是30℃。

2.4.2 pH 對菌株降解土霉素效果的影響 不同 pH 培養條件下，T4菌對土霉素的降解效果如圖5所示。當培養基pH值較低時，隨著pH值的升高，T4對土霉素的降解率也隨之增加，pH值為3時降解率為13.68%，當pH上升至7.0時降解率增至27.03%；當培養基pH大于7.0時，菌株對土霉素的降解能力隨pH的升高逐漸減小，pH為10.0時的降解率為21.66%，pH值為7.0時降解效果最佳，且與培養基的初始pH值相一致。

2.4.3 轉速對菌株降解土霉素效果的影響 由圖 6 可知，T4菌對土霉素的降解效果隨著轉速的提高先增大后減小，所有處理中T4菌對土霉素的降解率均在20%以上。其中，當轉速為150 rpm和170 rpm時T4菌對土霉素的降解率顯著高于其他處理，分別為26.18%和25.59%?？紤]到搖床高轉速耗能高的限制，選擇150 rpm作為優化的轉速。

2.4.4 接種量對菌株降解土霉素效果的影響 圖 7 表明，接種量為1%時降解率為26.68%，隨著接種量增加，T4菌對土霉素的降解率略有下降，當接種量增加至10%時降解率減小為23.83%。因此，綜合去除率和時間成本，選擇1%作為T4降解土霉素的適宜接種量。

圖 2 T4菌16S rDNA基因系統發育樹Fig. 2 16S rDNA gene system development tree of T4

圖 3 T4生長曲線Fig. 3 Growth curve of T4

2.4.5 優化條件下菌株對土霉素的降解效果 由前面的試驗結果可知，T4菌對土霉素降解效果的優化條件為溫度 30 ℃、pH 7.0、轉速 150 rpm、接種量1%。在優化的條件下，添加100 mg/L土霉素培養T4降解菌7 d之后，測得T4菌對土霉素的降解率為26.29%。

2.4.6 土霉素降解菌堆肥試驗結果 由圖 8 可知，在只加入了土霉素而沒有加入T4菌的OTC處理中，試驗結束土霉素的去除率為81.25%，而加入了T4菌的OTC + T4處理在試驗結束之后，其土霉素的去除率達到了93.21%，與OTC處理相比增加了11.96個百分點。由此可見，加入了T4菌后，土霉素的去除率有所提高，說明T4菌對于土霉素的進一步去除能夠起到促進作用，進而降低土霉素殘留。

圖 4 溫度對T4降解土霉素的影響Fig. 4 Effect of temperature on the degradation of oxytetracycline by T4

3 討論

圖 5 pH對T4降解土霉素的影響Fig. 5 Effect of pH on the degradation of oxytetracycline by T4

圖 6 轉速對T4降解土霉素的影響Fig. 6 Effect of rotation speed on the degradation of oxytetracycline by T4

圖 7 接種量對T4降解土霉素的影響Fig. 7 Effect of bacterium quantity on the degradation of oxytetracycline by T4

圖 8 堆肥中土霉素隨時間的降解率Fig. 8 Degradation of oxytetracycline with composting time

近年來，關于土霉素的研究報道越來越多。有報道稱采用堆肥技術可以降解畜禽糞便中的土霉素，但其降解時間相對較長，而對土霉素微生物降解的研究報道比較少。有研究表明，通過添加芽孢桿菌復合制劑到畜禽糞便中可以有效促進四環素類抗生素的降解[25]。本研究分離篩選的T4菌，經鑒定為假單胞菌 (Pseudomonas sp.)。有報道顯示，假單胞菌能夠有效降解有機磷農藥[26]、二氯酚[27]、毒死蜱[28–29]等有機污染物，而對土霉素的降解尚未見報道。有一些報道分離篩選得到部分土霉素降解菌，例如，從生產土霉素生產廠污水池底泥中分離得到一株能高效降解土霉素的蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)，最高可降解200 mg/L土霉素[30]；在之后進行的菌株降解功能驗證以及菌株降解活性測定的試驗中，進一步驗證了之前的結論。從長期受四環素類抗生素污染的土壤中篩選獲得一株高效降解菌Achromobacter xylosoxidans，對 60 mg/L 土霉素的降解率最高，達66.3%[14]。本研究篩選得到的土霉素降解菌對100 mg/L土霉素降解率相對較低，可能與土霉素添加量和菌株降解特性有關。

從本試驗結果看，溫度對微生物的新陳代謝有很明顯的調控作用，溫度過低或過高都會抑制微生物的生長，導致生長量較低，從而影響對土霉素的降解效果。pH也是影響微生物降解抗生素的主要因素之一。pH值太低或者太高都不利于T4菌對土霉素的降解，因為太酸性或太堿性的環境都對T4菌的新陳代謝產生了抑制，其內部的生化環境、菌體微觀結構、酶的活性都會發生相應的改變以此來適應外部環境的改變，進而影響到T4菌菌體的生長，導致土霉素的降解受到影響?？梢钥吹?，當pH大于7.0并逐漸提高時，土霉素的降解率相對酸性條件下較低，這可能與土霉素在酸性條件下結構不穩定引起化學降解有關，此時部分土霉素C環破裂，形成內酯型異構體，無法被檢測出[30]。轉速對土霉素降解也會有影響。因為轉速能夠為T4菌在降解土霉素的過程中提供所需的氧氣，促進T4菌的生長，從而促進其對土霉素的降解。轉速太低或是太高都會產生不利的影響，轉速太低可能無法為其提供充足的氧氣；轉速太高，可能又會導致菌體結構發生改變，影響其對土霉素的降解。接種量也是影響T4菌降解土霉素的一個因素，這可能是因為培養液里面的菌體之間會因為爭奪營養物質而產生競爭關系，從而影響其對土霉素的降解。

土霉素微生物降解研究目前仍處于起步階段，降解菌株缺乏，代謝機制以及實際應用的開展等方面都還有很多的工作需要去做。本研究篩選得到的T4菌株對土霉素有較好的降解作用，具有潛在的實際使用價值，為進一步找到土霉素生物降解酶打下了基礎，此外，繼續通過分子生物學方法探明菌株的降解基因，使其在微生物轉錄和翻譯中進行表達，將成為降解環境中土霉素的新方向，具有很好的潛在開發利用價值。

4 結論

1) 本研究得到一株能夠較好降解土霉素的菌株T4，通過16S rDNA基因序列分析，鑒定屬于假單胞菌 (Pseudomonas sp.)。

2) 實驗室條件下，T4菌對土霉素降解效果最佳的生長條件為溫度30℃、pH 7.0、轉速150 rpm、接種量1%。在該條件下培養降解菌7 d，對100 mg/L土霉素的降解率為26.29%。

3) 堆肥試驗表明，與對照相比，添加了T4菌的處理對土霉素去除有促進作用。

[1]Sassman S A, Lee L S. Sorption of three tetracyclines by several soils: Assessing the role of pH and cation exchange[J].Environmental Science & Technology, 2005, 39(19): 7452–7459.

[2]Kumar K, Gupta S C, Baidoo S K, et al. Antibiotic uptake by plants from soil fertilized with animal manure[J]. Journal of Environmental Quality, 2005, 34(6): 2082–2085.

[3]余伯良. 減少使用抗生索飼料添加劑的途徑[J]. 黑龍江畜牧獸醫,1998, (4): 21–22.Yu B L. Pathways of reduce the use of antibiotics feed additive[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 1998, (4):21–22.

[4]Zhou L J, Ying G G, Liu S, et al. Occurrence and fate of eleven classes of antibiotics in two typical wastewater treatment plants in South China[J]. Science of the Total Environment, 2013, 452–453(5):365–376.

[5]Pankaj K, Rossman F G, Diana S A. Investigating the molecular interactions of oxytetracycline in clay and organic matter: insights on factors affecting its mobility in soil[J]. Environmental Science &Technology, 2004, 38(15): 4097–4105.

[6]Halling-S?rensen B. Algal toxicity of antibacterial agents used in intensive farming[J]. Chemosphere, 2000, 40(7): 731–739.

[7]Jjemba P K. The potential impact of veterinary and human therapeutic agents in manure and biosolids on plants grown on arable land: a review[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2002,93(1): 267–278.

[8]趙紅梅, 金升藻. 濫用抗生素對人畜的危害及對策研究[J]. 國外醫藥抗生素分冊, 2003, 24(4): 164–167.Zhao H M, Jin S Z. The study of abuse of antibiotics and countermeasures to the harm of human and animal[J]. World Notes on Antibiotics, 2003, 24(4): 164–167.

[9]Sims J T. Agricultural and environmental issues in the management of poultry wastes: recent innovations and long-term challenges[J].Pediatric Research, 1997, 74(2): 163–169.

[10]Halling-S?rensen B, Norsn S, Lanzky P F, et al. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment-a review[J].Chemosphere, 1998, 36(2): 357–393.

[11]劉更另. 中國有機肥料[M]. 北京: 中國農業出版社, 1992.Liu G L. Organic fertilizer in China[M]. Beijing: China Agriculture Press, 1992.

[12]周啟星, 羅義, 王美娥. 抗生素的環境殘留、生態毒性及抗性基因污染[J]. 生態毒理學報, 2007, 2(3): 243–251.Zhou Q X, Luo Y, Wang M E. Environment residue ecological toxicity and antibiotics resistance gene pollution of antibiotics[J].Ecological Toxicology Report, 2007, 2(3): 243–251.

[13]王俊峰, 尹堯, 陳玉花, 等. 一株抗生素制藥工業廢水高效降解菌篩選及生物特性研究[J]. 安徽農業科學, 2014, 42(31): 10851–10852.Wang J F, Yin Y, Chen Y H, et al. Screening and its degrading properties of effective degradation strains for antibiotic production wastewater treatment[J]. Journal of Anhui Agricultural Science,2014, 42(31): 10851–10852.

[14]趙永斌. 3種四環素類抗生素降解菌的篩選及降解特性的研究[D].太谷: 山西農業大學碩士學位論文, 2015.Zhao Y B. The selection of 3 tetracycline to degrading bacteria and the character research of isolation and degrading[D]. Taigu, Shanxi:MS Thesis of Shanxi Agricultural University, 2015.

[15]劉婷婷, 董昆明, 繆莉, 等. 聯苯菊酯降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究[J]. 農業環境科學學報, 2012, 31(6): 1147–1152.Liu T T, Dong K M, Miu L, et al. Isolation, identification and biodegradation characteristics of a bacterial strain able to degrade Bifenthrin[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2012, 31(6):1147–1152.

[16]Esiobu N, Arments L, Ike J. Antibiotic resistance in soil and water environments used for various activities[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2002, 12: 133–144.

[17]Meyers E, Smith D A. Microbiological degradation of tetracyclines[J]. Journal of Bacteriology, 1962, 84(4): 797–802.

[18]劉力嘉, 謝麗, 張作義, 等. 泰樂菌素高效降解菌的篩選及降解特性研究[J]. 農業環境科學學報, 2011, 30(5): 1027–1030.Liu L J, Xie L, Zhang Z Y, et al. Isolation and degradation characteristics of a tylosin-degrading strain[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2011, 30(5): 1027–1030.

[19]張健, 關連珠. 豬糞中3種四環素類抗生素在土壤中的動態變化及降解途徑[J]. 植物營養與肥料學報, 2013, 19(3): 727–732.Zhang J, Guan L Z. Dynamics and mechanism of degradation of three tetracycline antibiotics from pig manures in soil[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2013, 19(3): 727–732.

[20]馮福鑫, 許旭萍, 程群星, 等. 四環素高效降解酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans XPY-10降解特性[J]. 環境工程學報, 2013, 7(12):4779–4785.Feng F X, Xu X P, Cheng Q X, et al. Degradation characteristics of tetracycline hydrochloride by Trichosporon mycotoxinivorans XPY-10[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2013, 7(12):4779–4785.

[21]Arikan O A, Mulbry W, Rice C. Management of antibiotic residues from agricultural sources: Use of composting to reduce chlortetracycline residues in beef manure from treated animals[J].Journal of Hazardous Materials, 2009, 164(2–3): 483–489.

[22]張長青. 土霉素高效降解菌的篩選及其降解特性研究[D]. 江蘇揚州: 揚州大學碩士學位論文, 2009.Zhang C Q. Isolation and degrading characteristics of oxytetracycline degrading bacteria[D]. Yangzhou, Jiangsu: MS Thesis of Yangzhou University, 2009.

[23]郭夢婷. 高土霉素殘留豬糞的高效好氧堆肥技術研究[D]. 杭州: 浙江工商大學碩士學位論文, 2011.Guo M T. The highly effective technology of aerobic compost of pig manure with high oxytetracycline[D]. Hangzhou: MS Thesis of Zhejiang Gongshang University, 2011.

[24]鮑艷宇. 四環素類抗生素在土壤中的環境行為及生態毒性研究[D]. 天津: 南開大學博士后出站報告, 2008.Bao Y Y. Environmental behavior and eco-toxicity of tetracycline antibiotics in soils[D]. Tianjin: Postdoctoral Report of Nankai University, 2008.

[25]張樹清, 張夫道, 劉秀梅, 等. 高溫堆肥對畜禽糞中抗生素降解和重金屬鈍化的作用[J]. 中國農業科學, 2006, 39(2): 337–343.Zhang S Q, Zhang F D, Liu X M, et al. Degradation of antibiotics and passivation of heavy metals during thermophile composting process[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2006, 39(2): 337–343.

[26]陳亞麗, 張先恩, 劉虹, 等. 甲基對硫磷降解菌假單胞菌WBC-3的篩選及其降解性能的研究[J]. 微生物學報, 2002, 42(4): 490–497.Chen Y L, Zhang X E, Liu H, et al. Study on Pseudomonas sp.WBC-3 capable of complete degradation of methylparathion[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2002, 42(4): 490–497.

[27]戴樹桂, 莊源益, 陳勇生, 等. 兩種假單孢菌中二氯酚降解酶活性及其定域研究[J]. 環境科學學報, 1996, 16(2): 173–178.Dai S G, Zhuang Y Y, Chen Y S, et al. Study on enzyme activity and distribution in two strains of bacteria by dichlorophenol degradation[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 1996, 16(2): 173–178.

[28]吳祥為, 花日茂, 操海群, 等. 毒死蜱降解菌的分離鑒定與降解效能測定[J]. 環境科學學報, 2006, 26(9): 1433–1439.Wu X W, Hua R M, Cao H Q, et al. Isolation, identification and degradation-efficiency measurement of chlorpyrifos degrading bacteria[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2006, 26(9): 1433–1439.

[29]周淑云. 毒死蜱高效降解菌的分離鑒定及其生物學特性研究[D].重慶: 西南大學碩士學位論文, 2006.Zhou S Y. Isolation and identification of chlorpyrifos-degrading bacterium and its biological characters[D]. Chongqing: MS Thesis of Southwest University, 2006.

[30]王志強, 張長青, 王維新. 土霉素降解菌的篩選及其降解特性研究[J]. 中國獸醫科學, 2011, 41(5): 536–540.Wang Z Q, Zhang C Q, Wang W X. Isolation and characterization of an oxytetracycline degrading bacterium[J]. Chinese Veterinary Science, 2011, 41(5): 536–540.