氮源對蛹蟲草產量及藥效物質產量影響的研究

李園園，楊 帆，姜美娜，許舒文，寇嘉賓，劉麗麗

（天津師范大學 生命科學學院，天津 300387）

人工栽培蛹蟲草可增加農業生產的經濟效益，蛹蟲草因其含有極高的藥用價值，其產量的增加要比一般農作物的產量增加帶來更高的經濟效益。蛹蟲草中含有豐富的藥效物質成分，其藥效物質生物活性成分與天然冬蟲夏草相似，而成為冬蟲夏草最常用的替代品。研究表明，蛹蟲草的生物活性成分主要有腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草酸等。腺苷具有改善心腦血液循環、松弛血管平滑肌、防止心率失常等生理活性，是深層大腦刺激效果的關鍵，可用來治療帕金森癥和有嚴重震顫患者[1]。蟲草素具有抗腫瘤、增強機體免疫力、抑菌與抗炎作用等作用[2]。蟲草多糖是蟲草中最重要、最豐富的藥理活性物質，有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等功效[3]。蟲草酸，即D-甘露醇，現已被認為是發酵蟲草菌絲體中活性成分的重要測試指標之一，具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮喘祛痰、抗自由基等藥理作用[4]。本試驗通過不同培養基培養蛹蟲草，篩選出生產藥效物質含量最高的蛹蟲草的培養條件，以期為大規模液體發酵用于農業栽培提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 蛹蟲草菌種，由天津師范大學微生物實驗室保存。

腺苷標準品（純度≥98%）、葡萄糖標準品（純度≥98%）、蟲草素標準品（純度≥98%）、甘露醇標準品（純度≥98%）購于天津泰艾瑞科技有限公司；甲醇（色譜純）、蒽酮（分析純）、硫酸（分析純）、高碘酸鈉（分析純）、醋酸銨（分析純），均購于天津瑞博星科技有限公司；蒸餾水、超純水。

1.1.2 栽培基質 PDA培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 儀器與設備

循環水式真空泵SHD-D（Ⅲ），鞏義市予華儀器有限公司；高效液相色譜儀Waters Alliance 2695，美國Waters公司；醫用超凈工作臺 SW-CJ-IF，蘇州安泰技術有限公司、超純水機UItra CLEAR，德國SG公司；紫外可見分光光度計 UA 2550，Shimadzu。

1.2 試驗方法

1.2.1 產量測定方法 取生長至30 d的蛹蟲草菌絲體，3 000 r·min-1離心6 min，去除上清液，置于60 ℃烘箱中烘干，測干重并記錄。

1.2.2 標準溶液制備 腺苷和蟲草素標準品的制備：分別準確稱取腺苷、蟲草素標準品各4 mg，溶入10 mL超純水中，制得400 μg·mL-1的腺苷、蟲草素標準儲備液。吸取腺苷、蟲草素標準儲備液適量，分別制得濃度為1、5、10、15、20、25、30 和 35 μg·mL-1的系列濃度標準品溶液。

蟲草多糖標準品的制備：稱取10 mg葡萄糖標準品，溶于10 mL蒸餾水中，制得1 mg·mL-1的葡萄糖標準品儲備液，備用。吸取1 mL葡萄糖儲備液用蒸餾水稀釋至10 mL，得0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 的 0.1 mg·mL-1葡萄糖標準液于試管中，分別加蒸餾水至1 mL，制得蟲草多糖標準品溶液。

蟲草酸標準品的制備：稱取10 mg甘露醇標準品，溶于10 mL蒸餾水中，制得1 mg·mL-1的甘露醇標準品儲備液，備用。吸取1 mL甘露醇儲備液用蒸餾水稀釋至10 mL，得0.1 mg·mL-1的甘露醇標準液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 的 0.1 mg·mL-1甘露醇標準液于試管中，分別加蒸餾水至1 mL，制得蟲草多糖標準品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取烘干的蛹蟲草菌絲體，研磨成粉末狀。稱取0.01 g蛹蟲草菌絲體粉于1.5 mL離心管中，加入1 mL超純水，超聲提取15 min，3 000 r·min-1離心6 min，吸取上清液即為供試品溶液。

1.2.4 藥效物質產量測定方法 腺苷和蟲草素用高效液相色譜測定，色譜條件為：Waters C18柱；流動相：甲醇-水（15∶85）；檢測器：紫外檢測器，檢測波長為260 nm; 柱溫30 ℃；進樣量20 μL, 流速 1 mL·min-1。

蟲草多糖用蒽酮硫酸法測定，即取1 mL待測溶液于試管中，加入4 mL蒽酮硫酸溶液（0.2 g蒽酮溶于100 mL 80%濃H2SO4），搖勻，沸水浴10 min，取出迅速冷卻至室溫，用紫外分光光度計測定其在625 nm 處的OD值，對照品為蒸餾水代替待測品溶液做同樣的操作。

蟲草酸的測定用高碘酸鉀比色法[4],取1 mL的待測溶液于試管中，加入1 mL高碘酸鉀溶液，搖勻，室溫反應10 min，加入2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液，搖勻，除去多余的高碘酸鉀，然后加入4 mL 新配置的Nash試劑，放入53 ℃恒溫水浴中15 min，使其呈色，之后迅速冷卻至室溫，用紫外分光光度計測定其在412 nm 處的OD值，對照品為蒸餾水代替待測品溶液做同樣的操作。

1.2.5 數據分析 采用Excel軟件對試驗數據進行處理，并采用 SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草產量測定

蠶蛹粉中因含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和微量元素等營養物質，而成為蛹蟲草栽培過程中常用的添加物，本試驗以PDA培養基為基礎，分別添加5%、10%和15%的蠶蛹粉浸提液為蛹蟲草的栽培基質，對照為PDA培養基不添加蠶蛹粉浸提液，栽培培養蛹蟲草，并測量蛹蟲草的產量，測定結果見表1。

表1 氮源對蛹蟲草產量的影響

由表1可知，栽培基質里添加蠶蛹粉浸提液確實能提高蛹蟲草的產量，而且隨著添加量的增加蛹蟲草的產量呈先增加后減少的趨勢，分析原因可能是蠶蛹粉浸提液比較粘稠，當其量達到一定程度時，會影響栽培基質的透氣性，從而影響蛹蟲草的產量。當栽培基質里蠶蛹粉浸提液的添加量為10%時，蛹蟲草的產量最高，且顯著高于其他各組，因此選擇PDA培養基添加10%蠶蛹粉浸提液為獲得蛹蟲草產量最大的最佳培養條件。

2.2 蛹蟲草藥效物質產量的測定

2.2.1 標準曲線的繪制 分別取腺苷和蟲草素標準品溶液按照1.2.4色譜條件進行測定，以標準溶液質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

腺苷標準曲線：

y=75 674x+7 648.6，R2=0.999 9；

蟲草素標準曲線：

y=87 031x+19 455，R2=0.999 2。

取已制好的蟲草多糖標準品溶液，按照1.2.4蒽酮硫酸法測定，以蟲草多糖標準品溶液的質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制標準曲線，得蟲草多糖標準曲線：y=0.010 2x+0.093 4，R2=0.999 9。

取已制好的蟲草酸標準品溶液，按照1.2.4高碘酸鉀比色法測定，以蟲草多酸標準品溶液的質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制標準曲線，得蟲草酸標準曲線：y=0.010 4x+0.022，R2=0.999 7。

2.2.2 精密度試驗 分別取濃度為 40 μg·mL-1的腺苷、蟲草素標準品，按照1.2.4色譜條件，連續進樣六次，測得腺苷和蟲草素的峰面積，計算得RSD分別為0.059%和0.141%，表明儀器的精密度良好。分別取濃度為40 μg·mL-1的葡萄糖、甘露醇標準品，按照1.2.4 測定方法，連續測定6次，記錄OD值，計算得RSD分別為0.937%和1.114%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批樣品，精密稱取冬蟲夏草菌絲體粉6份，按照1.2.3制備供試品溶液，按照1.2.4測定條件測定腺苷、蟲草素，蟲草多糖和蟲草酸含量，計算得RSD分為1.463%，2.213%，3.672%，1.853%，證明本方法的重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 取冬蟲夏草菌絲體粉，按照1.2.3制備供試品溶液，按照1.2.4測定條件分別在0、2、4、6、8 h測定，記錄腺苷和蟲草素的峰面積，記錄蟲草多糖和蟲草酸的OD值，計算得腺苷、蟲草素，蟲草多糖和蟲草酸的RSD分別為6.747%，2.262%，2.969%和1.607%，證明冬蟲夏草菌絲體中的腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草酸含量在8 h內穩定。

2.2.5 蛹蟲草藥效物質產量的測定 蛹蟲草產量的變化必然引起蛹蟲草藥效物質產量的變化，本研究在測蛹蟲草產量的基礎上進而測定了不同處理組蛹蟲草菌絲體粉和市售蛹蟲草菌絲體粉中的藥效物質的含量，結果如表2～5。

表2 氮源對蛹蟲草菌絲體腺苷產量的影響 （μg·mg-1）

表3 氮源對蛹蟲草菌絲體蟲草素產量量的影響 （μg·mg-1）

表4 氮源對蛹蟲草菌絲體蟲草多糖產量的影響 （μg·mg-1）

表5 氮源對蛹蟲草菌絲體蟲草酸產量的影響 （μg·mg-1）

由表2、3、5可以看出，隨著蠶蛹粉浸提液添加量的不同，蛹蟲草中的腺苷、蟲草素、蟲草酸含量呈先增加后降低的趨勢，五個處理組中，蛹蟲草腺苷、蟲草素、蟲草酸含量的差異幾乎都具有統計學意義（P≤0.05）。五個處理組中蛹蟲草腺苷含量分別為2.103 μg·mg-1，2.836 μg·mg-1，3.411 μg·mg-1，2.115 μg·mg-1，1.659 μg·mg-1，蟲草素含量分別為 2.257 μg·mg-1，3.941 μg·mg-1，6.281 μg·mg-1，2.498 μg·mg-1，3.462 μg·mg-1，蟲草酸含量分別為28.756 μg·mg-1，33.743 μg·mg-1，42.756 μg·mg-1，19.795 μg·mg-1，31.679 μg·mg-1。其中PDA培養基添加10%蠶蛹粉浸提液時，蛹蟲草的腺苷、蟲草素和蟲草酸的含量均最高，分別為 3.411 μg·mg-1，6.281 μg·mg-1和 42.756 μg·mg-1，顯著高于其他各組，故選擇PDA培養基添加10%蠶蛹粉浸提液為蛹蟲草產腺苷、蟲草素和蟲草酸含量最高的栽培基質。

由表4可以看出，蛹蟲草中的蟲草多糖的含量隨著蠶蛹粉浸提液添加量的增加而增加，5個處理組中，蛹蟲草蟲草多糖含量的差異幾乎都具有統計學意義（P≤0.05）。5個處理組中蛹蟲草蟲草多糖含量分別為1.322 μg·mg-1、4.051 μg·mg-1、6.600 μg·mg-1、10.084 μg·mg-1和6.122 μg·mg-1，其中添加15%蠶蛹粉浸提液的PDA培養基中蛹蟲草的蟲草多糖含量最高，為10.084 μg·mg-1，顯著高于其他各組，但考慮到蛹蟲草的綜合藥效最高，故選擇PDA培養基添加10%的蠶蛹粉浸提液為蛹蟲草產藥效物質含量最高的栽培基質。

3 結論與討論

蛹蟲草經濟價值主要體現于其產量和藥效成分含量的高低，隨著蛹蟲草生產規模的擴大和產品的開發，生產藥效價值高的蛹蟲草日益變成人們的迫切需求[5]。本研究測定了氮源對蛹蟲草產量及4種藥效物質腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草酸的含量的影響，并與市售蛹蟲草菌絲體粉中的這4種藥效成分含量做了對比。結果表明，PDA培養基添加10%蠶蛹粉浸提液時蛹蟲草的產量最高，藥效物質含量也最高，且顯著高于市售蛹蟲草菌絲體粉的藥效成分含量，因此選用PDA培養基添加10%蠶蛹粉浸提液作為蛹蟲草的最佳栽培基質，可用于蛹蟲草的大規模栽培種植。本研究中蛹蟲草腺苷、蟲草素和蟲草酸含量隨著培養基中蠶蛹粉含量的升高而出現先上升后下降的趨勢，這與李菲等[6]添加蠶蛹粉對蛹蟲草生長及子實體有效成分的影響的研究結果一致，而蟲草多糖含量隨著培養基中蠶蛹粉浸提液含量的升高而升高，其具體影響機制還有待研究。

[1]于戈，王麗，胡欣蕾，等.響應面法優化蛹蟲草固態發酵產物蟲草素與腺苷綜合提取工藝[J/OL].食品科學，1-12(2017-08-02). http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20170802.1547.048.html.

[2]劉桂君，周思靜，楊素玲，等.蛹蟲草中蟲草素的研究進展[J].食品科學，2013，34（21）： 408-413.

[3]張杰，孫源.超聲提取蛹蟲草多糖及其抗氧化活性分析[J].食品科技，2013，38（5）：203-207.

[4]蔡友華，范文霞，劉學銘，等.比色法測定巴西蟲草菌絲體中蟲草酸的含量[J].現代食品科技，2008，24（1）：76-79.

[5]陸巍杰，唐永范，高瑞棟.HPLC法測定北冬蟲夏草和常見食用菌中腺苷和蟲草素[J].現代藥物與臨床，2011，26（4）：313-315.

[6] 李菲，王忠，卞文印，等.添加蠶蛹粉對蛹蟲草生長及子實體有效成分的影響[J].武學，2016（32）：69-73.