抑制‘白花油茶’葉片外植體褐化和誘導愈傷組織的研究

黃國文，黃超超，譚 毅

（湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199）

油茶Camellia oleifera，屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia[1]，是我國南方的木本油料樹種。油茶育苗主要是培育優良無性系，但是所需的時間長，扦插很難生根，嫁接時成苗率低，因此很難在短時間內培養出優良無性系[2]。植物組織培養技術在植物脫毒和快繁、獲取次級代謝產物以及利用基因工程等方面發揮著越來越重要的作用[3]。用無性系“湘林1號”和“湘林4號”油茶無菌苗的葉片、莖尖和莖段作為外植體，用IBA，KT，2,4-D和NAA四種激素[4]，6-BA和NAA[5]以及6-BA（2.0 mg·L-1）和2,4-D（0.5 mg·L-1）[6]都能夠容易地誘導出葉片愈傷組織，但是對于大田栽培的成熟油茶葉片，僅僅利用在培養基中加入一點激素的常規條件進行組織培養，外植體褐化現象很普遍，存活率低，甚至全部外植體因褐化而死亡。外植體的褐化可能是外植體中多酚含量高和多酚氧化酶活性高引起的[5,7]。目前，抑制植物組織培養中外植體褐化的方法有多種，如接種前用100 mg·L-1維生素C（Vc）溶液浸泡非洲菊Gerbera jamesonii外植體1 h[8]，用Vc浸泡香蕉Musa nana芽[9]，用檸檬酸和Na2S2O3浸泡白玉蘭Magnolia denudata芽[10]，在培養基中添加活性炭（Ac）[11]和抗氧化劑[12]，在紅豆杉Taxus chinensis愈傷組織培養基中添加葡萄糖（Glu）和果糖[13-14]等都能夠抑制外植體褐化，提高外植體存活率及愈傷組織誘導率。油茶組織培養中，有低溫預處理油茶葉片7 d和培養基中加入0.3 mg·L-1Ac來抑制外植體褐化[6]的報道，但主要集中在改變培養基中激素種類和濃度配方上，對組培過程中的機理缺乏充分研究，距離實際應用還有一定的距離，還不能實現工業化生產[15-16]。因此，用不同的油茶品種，不同生理狀態的植株甚至不同的器官來進行組織培養，對于理解組織培養的機理和掌握油茶組培條件是很必要的。由于用油茶器官在培養基上培養無菌苗的時間長、生長慢，利用無菌苗作為外植體會延長油茶組培的時間，然而用大田栽培的油茶葉片作為外植體，節約實驗費用，減少步驟，加快組培進程。

本研究以普通栽培‘白花油茶’葉片作為外植體，把‘白花油茶’嫩枝放在室內進行弱光培養，用 Vc漂洗外植體，在培養基中加入Ac和Vc防止培養時葉片外植體褐化，對激素配比、基本培養基類型、瓊脂含量和組合糖等因素進行單因素實驗，不同組合實驗研究誘導油茶愈傷組織的最適培養條件，為再分化‘白花油茶’植株打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年3－6月，在湖南科技學院油茶示范基地采集‘白花油茶’的側枝頂部光照充足的一年生枝條，以葉片作為外植體進行培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒和取材方法 取室內弱光處水培1～ 2 d的一年生枝條，用剪刀剪斷葉柄得到質地稍厚的20片葉左右，在自來水下沖洗30 min，用棉花輕輕地擦洗后瀝干，切去葉柄和葉尖放入燒杯中帶到超凈工作臺上。用75%酒精消毒30 s后用無菌水反復沖洗3次，再用1.0 g·L-1HgCl2處理7 min，對于顏色深綠的較老葉片，消毒時間增加到10 min，用無菌水沖洗5次，最后瀝去水分，放置于無菌濾紙上。用滅菌的剪刀剪去葉片邊緣并切成1.5 cm×1.5 cm大小的外植體，用于進一步的預處理和接種后培養。

1.2.2 ‘白花油茶’葉片外植體的防褐化方法

1.2.2.1 培養基中添加Vc和Ac對葉片外植體活性的效應 在特定培養基（MS培養基，含有1.0 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12,4-D，瓊脂含量為7.0 g·L-1，蔗糖（Suc）含量為30 g·L-1，調節pH 5.8）上，分別添加0.2，0.3，0.4 g·L-1Vc，0.5，1.0，2.0 g·L-1Ac，其中以 0.3 g·L-1Vc分別與 0.5，1.0，2.0 g·L-1Ac的組合作為處理組，一組為不加Ac和Vc為對照組。將消毒瀝干的外植體接種到這些培養基上培養。每組接種10瓶，每瓶接種3個外植體，定期觀察和記錄結果。

1.2.2.2 Vc與Ac溶液漂洗外植體的活性效應 酒精消毒后切好的葉片分成10組：對照組在無菌水中浸泡3 min，實驗組分別在 0.2，0.3，0.4 g·L-1Vc溶液，1，2，3 g·L-1Ac粉末液體，0.2，0.3，0.4 g·L-1Vc與 1 g·L-1Ac粉末組合混合液中浸泡3 min。用1.0 g·L-1HgCl2處理并沖洗瀝干。然后將外植體接種到含有0.3 g·L-1Vc和1 g·L-1Ac的基本培養基上。每組接種5瓶，每瓶接種3個外植體，培養箱溫度在（25±2）℃。

1.2.2.3 室內弱光下水培‘白花油茶’嫩枝對外植體活性的效應 摘取帶有20片葉左右且有嫩葉展開的枝條3根，枝條長度10 cm左右，插在盛自來水的燒杯中，放置在室溫25℃的室內光線較暗的角落分別培養1，2，3 d。每天下午取葉片消毒，0.3 g·L-1Vc預處理的制備外植體，接種在含有0.3 g·L-1Vc和1.0 g·L-1Ac的基本培養基上進行培養。每組接種5瓶，每瓶接種3個外植體，記錄外植體存活率及愈傷組織誘導情況。

1.2.3 誘導‘白花油茶’葉片外植體愈傷組織的單因素實驗 取室內弱光水培2 d的枝條上的葉片切取外植體，消毒后用 0.3 g·L-1Vc 漂洗 3 min，瀝干后用于接種。以 7.0 g·L-1瓊脂，30 g·L-1Suc，添加 0.3 g·L-1Vc和 1.0 g·L-1Ac的MS基本培養基；1 mg·L-1的6-BA和1 mg·L-1的2,4-D為最初培養基的成分。當變動一個因素時，其它因素與最初培養基中成分一致。植物激素濃度配比為0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1的6-BA和1.5 mg·L-1的2,4-D以及 1.0 mg·L-1的 6-BA 和 0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1的 2,4-D；瓊脂濃度為 6.0，6.5，7.0，8.0 g·L-1；基本培養基為 WPM，MS，1/2MS；糖類處理為 30 g·L-1Suc，30 g·L-1Suc，16 g·L-1Glu，30 g·L-1Glu，40 g·L-1Glu，15 g·L-1Suc + 15 g·L-1Glu，誘導愈傷組織的形成，總共21組，每組接種5瓶，每瓶接種3個外植體。觀察記錄外植體存活情況以及愈傷組織誘導情況。

1.2.4 組合實驗優化誘導愈傷組織的條件 根據植物激素配比、培養基類型、瓊脂濃度和糖類4個因素確定的適宜條件，按L9（34）正交實驗方法進行不同組合實驗，得出‘白花油茶’最佳愈傷組織誘導條件。綜合評分為外植體成活率、愈傷組織誘導率和愈傷組織生長狀況得分之和。100%成活率計3分，100%誘導率計6分；愈傷組織長勢好計3分（長勢一般和長勢差依次減一分），愈傷組織表面疏松計2分（表面光滑致密計1分），愈傷組織的可見時間以15 d計3分，每增加1 d扣0.2分，每減少1 d加0.2分。

1.3 數據處理

在培養第 16天后觀察和統計外植體存活（仍然為綠色或者產生了愈傷組織）量以及褐化死亡（排除染菌死亡）量。計算外植體的存活率和愈傷組織誘導率，公式如下：

存活率（%）=（接種外植體總數－外植體褐化數）/接種外植體總數×100

誘導率（%）= 誘導出愈傷組織的外植體數/接種外植體總數×100

2 結果與分析

2.1 抑制‘白花油茶’葉片外植體的褐化作用

2.1.1 在培養基中添加Vc和Ac對‘白花油茶’葉片外植體褐化的影響 植物組織培養過程中，外植體褐化是阻礙愈傷組織生長的最大因素，防止外植體褐化有利于誘導愈傷組織。在接種‘白花油茶’外植體的培養基中加入Ac和Vc對預防‘白花油茶’外植體褐化有一定的效果，也影響了愈傷組織誘導率（表1）。在培養基中單獨添加Ac的防褐化效果普遍優于單獨加入Vc的作用，兩者一起加入對抑制外植體褐化的作用更強。1.0 g·L-1Ac和0.3 g·L-1Vc條件下的外植體存活率為70.0%，誘導率最高為33.33%?？赡苁怯捎赩c是一種抗氧化試劑，能夠防止外植體切口流出的多酚氧化成醌類褐化切口，但是隨著作用時間的增長Vc被降解，其還原態轉化成氧化態，導致多酚物質的氧化從而使材料褐化。然而，Ac有吸附多酚的作用，且作用時間長，Vc和Ac兩者共同作用會更好地除去葉片細胞釋放的多酚物質的作用，使外植體的細胞活性加強。

表1 培養基中添加Vc和Ac對‘白花油茶’葉片外植體褐化和愈傷組織的影響Table 1 Effect of addition of vitamin C or activated carbon or both in culture medium on browning of explant and callus

2.1.2 Vc與Ac溶液漂洗外植體對抑制外植體褐化的影響 在實驗過程中，剛剪成小塊的‘白花油茶’葉片四周切口顏色會很快變成淺褐色，直接影響到外植體的存活率及愈傷組織誘導率。用Vc及Ac粉末溶液漂洗剪切的外植體可以減輕外植體褐化并提高愈傷組織誘導率（表2）。實驗表明，單獨用Ac粉末的懸濁溶液漂洗外植體與空白組的結果相差不大，外植體存活率為67%左右，愈傷組織誘導率為30%左右，說明單獨用Ac粉末溶液漂洗外植體未能夠提高外植體的存活率。單獨使用 Vc漂洗外植體，外植體存活率及誘導率顯著提高，采用0.3 g·L-1Vc時效果最好，存活率為80.0%，誘導率為50.0%。這說明Vc溶液在前期處理外植體時可以較好地抑制酚類物質氧化，防止外植體四周切口出現褐化。

與單獨使用0.3 g·L-1Vc相比，用0.3 g·L-1Vc和2.0 g·L-1Ac處理的外植體存活率從80.0%降到73.33%，誘導率從50.0%降低到48.0%。說明Ac與Vc溶液共同使用時，Ac也會對Vc產生一定的吸附作用，因而產生負面效應。因此單獨使用0.3 g·L-1Vc溶液預處理外植體3 min有利于抑制酚類物質氧化。

表2 Vc和Ac漂洗外植體對葉片外植體褐化和愈傷組織的影響Table 2 Effect of washing of explants with vitamine C and activated carbon on browning and callus

2.1.3 室內水培嫩枝對抑制‘白花油茶’外植體褐化的影響 室內水培枝條能夠影響‘白花油茶’外植體存活率和愈傷組織誘導率（表3）。室內環境水培處理1～2 d的外植體存活率最高，達到80.0%以上，愈傷組織的誘導率也同樣。說明室內水培處理后，可能使葉片表面疏松，降低葉片細胞中多酚氧化酶的活性，防止了外植體切口組織中多酚的氧化，因而提高了外植體存活率。

表3 室內水培時間對抑制葉片外植體褐化和愈傷組織的影響Table 3 Effect of indoor water culture days on browning of explant and callus

2.2 誘導‘白花油茶’葉片外植體愈傷組織的單因素實驗

2.2.1 外源激素濃度對愈傷組織誘導的影響 外源植物激素配比影響‘白花油茶’外植體的愈傷組織的分化（表4）。6-BA濃度為1.0 mg·L-1，2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時在第10天就誘導出愈傷組織，愈傷組織疏松、帶有淡淡的綠色；6-BA濃度為1.0 mg·L-1，2,4-D濃度為1.5 mg·L-1時，第12天可以誘導出愈傷組織，愈傷組織誘導率最大為52.67%。2,4-D的濃度低于1.0 mg·L-1時，愈傷組織較難形成，且出現的時間長，因此，在一定范圍內提高2,4-D的濃度有利于愈傷組織的形成。

2.2.2 瓊脂濃度對外植體愈傷組織誘導的影響 在添加1.0 g·L-1Ac和0.3 g·L-1Vc的MS培養基中，瓊脂濃度對外植體存活率及愈傷組織誘導有影響（表5）。當瓊脂濃度為6.5 g·L-1時，外植體存活率最大達到83.33%，此時愈傷組織誘導率為53.67%。當瓊脂濃度大于6.5 g·L-1，隨著瓊脂濃度的增加，愈傷組織誘導率逐漸降低，而存活率先增加后降低。說明，瓊脂濃度過高可能阻礙營養物質的傳遞，導致愈傷組織出現較晚生長較慢；瓊脂濃度過低，可能使外植體細胞活性和外植體存活率降低而且容易引起愈傷組織的玻璃化。

表4 外源激素對外植體愈傷組織誘導的影響Table 4 Effect of the exogenous hormones on the induction of callus of explants

表5 瓊脂濃度對‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導的影響Table 5 Effect of agar concentration on induction of callus of explants

2.2.3 培養基種類對愈傷組織誘導的影響 培養基種類對‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導有影響（表6）。外植體在3種培養基上的愈傷組織的誘導率從大到小的順序依次為WPM>1/2MS>MS。在WPM培養基上，外植體存活率最高，第12天時出現愈傷組織，且愈傷組織致密、生長快。在MS培養基上，外植體第16天時出現愈傷組織，愈傷組織致密、生長較快。在1/2MS培養基上，外植體第15天時出現愈傷組織，愈傷組織疏松，生長較差。

表6 不同類型培養基對外植體愈傷組織誘導的影響Table 6 Effect of different culture media on induction of callus of explants

2.2.4 糖的種類和濃度對愈傷組織誘導的影響 培養基中糖的種類影響‘白花油茶’外植體愈傷組織的誘導形成（表7）。在含30 g·L-1Glu，40 g·L-1Glu或者15 g·L-1Suc + 15 g·L-1Glu的培養基上外植體存活率均達80%以上，外植體愈傷組織誘導率以15 g·L-1Suc + 15 g·L-1Glu最高，40 g·L-1Glu的為其次。在添加40 g·L-1Glu或者15 g·L-1Suc和15 g·L-1Glu的培養基上，分別在第9天和第8天誘導出愈傷組織。說明Glu誘導外植體分化出愈傷組織的作用優于Suc。

表7 單獨Suc或Glu和兩者對外植體愈傷組織誘導的影響Table 7 Effect of single sucrose or glucose and both on induction of callus of explants

2.3 組合實驗

根據單因素實驗結果，以瓊脂濃度、植物激素配比和糖類型的三個較好水平與培養基類型進行組合實驗設計（表8），仿照正交實驗L9（34）來進行組合實驗，并對各個實驗結果進行綜合評分和極差分析（表9和表10），以確定誘導‘白花油茶’外植體愈傷組織生長的最佳組合條件。

表8 ‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導組合實驗設計Table 8 Experiment design for induction of callus of Camellia oleifera explants

表9 ‘白花油茶’愈傷組織誘導的組合實驗結果Table 9 Result of the experiment

表10 ‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導的組合實驗結果分析Table 10 Analysis on experiment result

極差分析表明，影響成熟‘白花油茶’外植體愈傷組織誘導的因素大小順序是糖類>植物激素配比>瓊脂濃度>培養基?！谆ㄓ筒琛庵搀w愈傷組織誘導的最優培養條件為 WPM+6.5 g·L-1瓊脂+15 g·L-1Suc+15 g·L-1Glu+1.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA。

經過驗證，在最優培養條件下，成熟‘白花油茶’植株葉片外植體的成活率為95%以上，愈傷組織誘導率為90%左右。本培養條件下獲得的愈傷組織（圖1）白色透亮，質地疏松、長勢好。

圖1 接種第16天‘白花油茶’外植體的愈傷組織Figure 1 The callus of explant 16 days after inoculation

3 結論與討論

‘白花油茶’組織培養過程涉及到外植體及其細胞的生理過程的變化，外植體褐化導致愈傷組織形成受阻甚至細胞死亡是‘白花油茶’組織培養中最主要問題。油茶組培苗用芽和莖等器官培養成植株，成苗系數大，用來培養優良無性系。無菌的組培苗器官作為外植體，可以免除消毒時對其的傷害，同時苗相對弱小、次生代謝產物積累少，有利于誘導愈傷組織形成。野外苗木由于受到空氣中微生物的污染和次生代謝產物積累較多，組培時外植體褐化嚴重、愈傷組織誘導率低，但是省略培養植株的步驟，節約實驗時間和成本，加快愈傷組織的培養進程。取長度為10 cm左右的嫩枝在室內弱光下水培1～2 d后的葉片作為外植體，可以提高其存活率，可能降低了其酶活力并消耗了葉內淀粉。這與水培蘋果梨Pyrus pyrifolia ‘Pingguoli’組織來提高外植體存活率的結論相吻合[17]，在用HgCl2滅菌消毒外植體后，用0.3 g·L-1Vc溶液漂洗外植體一定時間，能夠洗去外植體切口上流出的多酚物質提高了其成活率，但用Ac懸濁液漂洗外植體的效果差；在培養基里加入1.0 g·L-1Ac和0.3 g·L-1Vc溶液可以消除組培過程中外植體產生的多酚物質的氧化作用，從而預防了外植體的褐化并提高了存活率。以糖類、激素配比、培養基種類和瓊脂含量4個因素進行不同組合實驗，表明影響外植體愈傷組織形成最主要的因素是糖類，其次是激素配比，可能15 g·L-1Glu + 15 g·L-1Suc的組合中Glu能夠快速進入細胞，為細胞提供了快速能源物質，從而刺激了因室內弱光培養產生的葉片饑餓細胞的活性和對外界條件的反應敏感性，促進了愈傷組織的形成；激素配比雖然是愈傷組織形成不可缺少的，但是如果細胞活性小甚至失去活性這些激素也無法起作用。此外，WPM優于MS，可能是WPM中的Ca2+濃度是MS的2倍，維生素B1濃度也明顯高于 MS。Ca2+能夠促進細胞生長和分化，影響植物細胞的生長[18-19]，也是促進愈傷組織形成的重要因素[20]；維生素B1在一定程度上可以提高愈傷組織的活力。如果培養1～2 d發現外植體邊緣褐化，立即剪去褐化部分，繼續放在培養基中培養，這時外植體成活率幾乎達100%，愈傷組織的誘導率將會達到95%左右。

本實驗結果顯示，‘白花油茶’葉片愈傷組織誘導的最佳條件是以水培1～2 d的‘白花油茶’枝條的葉片作為外植體，并用0.3 g·L-1Vc漂洗外植體2～3 min。優化的培養基配方為WPM + 6.5 g·L-1瓊脂 + 15 g·L-1Suc +15 g·L-1Glu + 1.5 mg·L-12,4-D + 1.0 mg·L-16-BA + 1.0 g·L-1Ac + 0.3 g·L-1Vc。葉片愈傷組織誘導包括防止外植體褐化以促進外植體成活、刺激細胞對培養條件的反應活性和誘導愈傷組織形成，做好這3個方面的工作能夠有效提高愈傷組織的誘導率。

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