冬蟲夏草對哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2表達的影響

蔣珍鳳 羅冬嬌 童夏生 范廣民 王恩智

冬蟲夏草富含多糖、氨基酸、脂肪酸、甘露醇及多種微量元素等，具有調節機體免疫、改善糖尿病腎病的病情、誘導腫瘤細胞凋亡等多種作用[1-2]。核苷酸結合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體是模式識別受體的一種，參與細胞內信號傳導，在天然免疫系統中起著非常重要的作用，參與機體的抗感染、炎癥性腸病、腫瘤等多種疾病的發病機制[3-4]。本研究觀察冬蟲夏草對哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料 兔抗鼠多克隆NOD2抗體購自biorbyt公司（批號P10336）；Ⅴ級卵白蛋白（OVA）（批號：A5503）購自美國Sigma公司。冬蟲夏草150g，購于西藏自治區拉薩正清商貿有限公司，文火煎沸3h，濾出煎液，同前復煎1次，兩次液體混勻后（約600mL），4℃冰箱保存備用。

1.2 實驗動物及分組 24只清潔級健康雄性SD大鼠[許可證號：SCXK（浙）20140001]，4～5 周齡，平均體質量128g，飼養于杭州師范大學實驗動物中心，自由進食和飲水。按照數字表隨機分為哮喘組、對照組、冬蟲夏草組，每組8只。

1.3 大鼠哮喘模型制備及給藥 參照文獻[5]，采用OVA致敏的方法復制哮喘模型。冬蟲夏草組在OVA霧化激發前一天開始至霧化結束，每天1次給予冬蟲夏草5mL/只灌胃[6]，共15天。

1.4 留取肺組織 OVA霧化結束后次日，水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟抽血至死。取左肺外緣組織，剪成0.5cm×0.5cm大小塊狀，液氮保存，實時熒光定量PCR法（qPCR）檢測肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達量。另取左肺門組織，多聚甲醛固定、切片，HE染色觀察肺組織炎癥變化，免疫組化法檢測NOD2表達量。

1.5 免疫組化SP法檢測 陽性細胞胞漿呈棕黃色表達，每張切片隨機選擇5個視野，Image-pro Plus 5.1免疫組化圖像分析系統對陽性細胞進行灰度掃描，取其平均值代表該片的光密度（optical density，OD）值[5]。

1.6 qPCR檢測方法檢測肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達[5]研磨肺組織，Trizol-離心柱法提取總RNA，轉錄成cDNA。NOD1的上游引物為5’-AGCT AACCTCCTAAGCGGGA-3’，下游引物為 5’-TCGGT GACCAGCAGAAAGAC-3’，產物大小為 348bp；NOD2的上游引物為5’-FCCTTTGAACTGCAAGGGTGC-3’，下游引物為 5’-RGGCAAAGATTCTCCGACCCA-3’，產物大小為396bp；內參β-Actin的上游引物為5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物為 5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’， 產物大小為150bp。結果分析采用比較 CT值法：△△CT=（CTNOD-CTβ-actin） 實驗組-（CTNOD-CTβ-actin）對照組，基因相對表達量（RQ值）采用2-△△CT方法計算。

1.7 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩變量相關分析采用直線相關分析法，數據以均數±標準差（±s） 表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD2蛋白表達比較

陽性細胞主要為氣道上皮細胞、淋巴細胞等，其胞漿呈棕黃色表達。哮喘組大鼠肺組織NOD2蛋白的光密度值顯著低于對照組（P＜0.01），冬蟲夏草組顯著高于哮喘組（P＜0.05）。見表 1、封四圖 1。

表1 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD2表達量比較（±s）

表1 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD2表達量比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與哮喘組比較，△P＜0.05；NOD：核苷酸結合寡聚域

組別對照組哮喘組冬蟲夏草組鼠數888 NOD2（OD 值）0.24±0.03 0.18±0.03**0.23±0.02△

2.2 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達比較 抽提物總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，目的基因NOD1、NOD2和內參基因β-actin的熔解曲線均為單一峰，基因擴增曲線呈標準S型。哮喘組大鼠肺組織NOD1 mRNA表達量顯著低于對照組（P＜0.01）；冬蟲夏草組大鼠肺組織NOD1 mRNA表達量顯著高于哮喘組（P＜0.01）。哮喘組大鼠肺組織NOD2 mRNA表達量與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；冬蟲夏草組大鼠肺組織NOD2 mRNA表達量顯著高于哮喘組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達量比較（±s）

表2 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達量比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與哮喘組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；NOD：核苷酸結合寡聚域

鼠數組別對照組哮喘組冬蟲夏草組888 NOD1 RQ 值（2-△△CT）1 0.62±0.34**0.98±0.22△△NOD2 RQ 值（2-△△CT）1 0.92±0.32 1.27±0.48△

2.3 各組哮喘模型大鼠肺組織炎癥 HE染色顯示，對照組肺組織結構完整、細胞清晰，炎癥細胞和支氣管腔內分泌物少見；哮喘組見上皮細胞和黏液腺增生，見較多炎性細胞，有些管腔見黏液栓等；冬蟲夏草組炎性改變較哮喘組減輕（見封四圖2）。

2.4 相關性分析 哮喘模型大鼠肺組織NOD2 mRNA與蛋白表達水平無顯著相關性（n=24，r=0.32，P＞0.05）；NOD1 mRNA 與 NOD2 mRNA 表達水平無顯著相關性（n=24，r=0.20，P＞0.05）。

3 討論

模式識別受體包括膜結合受體和細胞內模式識別受體等，前者包括Toll樣受體，后者包括NOD樣受體。迄今為止，共發現22個NOD樣受體家族成員，其中最具代表性的是NOD1和NOD2。NOD樣受體分布于細胞胞漿中，可以識別進入細胞內的病原體及其產物，在天然免疫中發揮重要作用。研究[7]發現，NOD樣受體與多種肺部炎癥性疾病有關，例哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺損傷等，但其機制尚未清楚。

本研究發現，NOD2表達于肺組織的氣道上皮細胞、淋巴細胞等，且哮喘組大鼠肺組織NOD2蛋白的表達水平低于對照組（P＜0.01），提示NOD2可能與哮喘的氣道炎癥密切相關。同時發現哮喘組大鼠NOD2 mRNA的表達量與對照組無差異（P＞0.05）。相關分析表明，大鼠肺組織NOD2 mRNA和蛋白的表達水平無顯著相關性（P＞0.05）。相似的結果也見于其他學者的報道，在哮喘大鼠肺組織NOD2蛋白表達下降，認為NOD2表達減弱可能與哮喘氣道炎癥有關[8]。通過流式細胞術也發現，在哮喘患者趨化因子CCR3陽性的粒細胞中，NOD2表達下降[9]。而在急性發作期哮喘患者外周單個核細胞中，NOD2 mRNA表達量高于慢性持續期哮喘患者且高于健康對照組，認為NOD2 mRNA表達增加促進哮喘炎癥并與哮喘嚴重程度相關[10]。以上研究發現，哮喘NOD2 mRNA表達不一致的原因可能與其表達的組織或細胞不同有關。本研究同時還發現，哮喘組大鼠肺組織NOD1 mRNA 表達水平低于對照組（P＜0.01），提示NOD1 mRNA表達不足可能與哮喘氣道炎癥有關。通過相關分析發現，NOD1和NOD2 mRNA無顯著相關性（P＞0.05），提示NOD家族mRNA水平的改變不具有一致性。

目前認為，NOD1和NOD2的失調與多種炎癥性疾病相關，選擇性地抑制以它們及其下游區的信號蛋白為靶點可能是治療疾病的有效方法[11]。冬蟲夏草是一種屬于中藥的免疫調節劑，蟲草素是冬蟲夏草上的主要活性成分，具有降血脂、抗腫瘤、減輕哮喘癥狀的功效[12]，但其治療機制尚未完全清楚。本研究結果顯示，冬蟲夏草組大鼠肺組織炎癥細胞、炎癥反應較哮喘組減輕，且冬蟲夏草組大鼠NOD2蛋白及mRNA和NOD1 mRNA表達水平高于哮喘組，提示冬蟲夏草可能具有上調NOD1和NOD2表達的作用，通過上調模式識別受體的表達起到減輕哮喘氣道炎癥的作用。相似的研究[13]也發現，蟲草多糖能減少哮喘患者氣道中炎癥細胞的浸潤、減輕氣道上皮損傷和水腫、降低氣道高反應、下調炎癥因子的釋放。在慢性阻塞性肺疾病中，冬蟲夏草具有減輕癥狀、改善肺功能、提高生存質量、增強心功能等作用，其治療機制可能通過增強免疫功能、抑制炎癥反應和減輕氧化應激反應等[14]。

綜上所述，哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2的表達下降，冬蟲夏草能上調哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2的表達，冬蟲夏草可能通過上調模式識別受體的水平起到治療哮喘的作用。

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