李 海 楊 潔 陳建海 黃炳臣 黃海玲 王金花 方曉燕 黎 飚
(右江民族醫學院,廣西 百色 533000)
老年性骨質疏松(OP)中絕經后OP(PMOP)發病率最高,臨床癥狀最重,與營養、種族、遺傳和年齡有關,PMOP的骨質流失大于骨質生成,與卵巢功能降低,女性激素水平下降,引起破骨細胞吸收骨質增加有關。山茶籽油內含植物性雌激素〔1〕。研究表明骨質流失與雌激素受體(ER)的不同基因型有關〔2〕。本課題擬探討ER-β不同基因型與山茶籽油相互作用對防治廣西百色壯族婦女PMOP的影響。
1.1對象 長期非食用山茶籽油(NECO)廣西百色壯族40~80歲婦女619人,長期食用山茶籽油(ECO)40~80歲婦女598人,排除肝、腎、肺、心及內分泌等器官疾患,無摘除卵巢病史,也未服用激素等對骨代謝有影響藥物。檢測對象均無長時間外出經歷,3代祖宗均屬純壯族。ECO組長期食用山茶籽油,極少食用其他植物油或動物油,而NECO組長期食用花生油或動物油。
1.2超聲骨密度測定 采用法國生產的超聲定量骨密度儀(QUS)檢測右側跟骨超聲寬帶衰減值(BUA)。每次測定前均由專門技術員開機進行校對。按照我國OP臨床診斷標準,與廣西百色地區相關人群正常的骨峰值(PBM)比較BUA減少值≤2.0為正常組,>2.0為PMOP組。
1.3ER基因多態性測定
1.3.1設計和合成引物 根據相關文獻進行引物設計〔3〕,ER-β基因擴增Rsa I位點上游引物:5′-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3′,下游引物:5′-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3′。特異性擴增ER-β基因Alu多態性相應位點一段DNA引物的序列P1:5′-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3′,P2:5′-AATGAGGGACCACAGCA-3′,PCR終產物片段長度為307 bp。
1.3.2提取DNA模板 用碘化鈉(NaI)DNA提取法,取乙二胺四乙酸抗凝的全血100 μl加入滅菌雙蒸餾水100 μl進行混勻,加入6 mol/L NaI 200 μl進行渦旋震蕩30 s,再加入相等體積的異戊醇/氯仿(1∶24)進行渦旋震蕩30 s,經離心取其上清液再加入0.6倍體積的異丙醇并拌勻,4℃靜置15 min,經離心沉淀后用70%乙醇洗滌1次,晾干物溶于TE緩沖液中,測定提取模板DNA后,置于-20℃冰箱保存備用。
1.3.3PCR擴增〔4〕反應體系50 μl,其中內含有10倍緩沖擴增液、dNTPs各200 μmol/L,引物P1和P2各0.4 μmol/L,DNA模板物0.1 μg。置于熱循環儀內(Bio-Rad型,日本)中95℃預變性5 min,再注入Taq DNA聚合酶2.5 U。94℃變性30 s,55℃退火50 s,72℃延伸45 s,72℃末次進行延伸10 min,循環35次。
1.3.4擴增產物用限制性酶進行酶切 取PCR擴增產物10 μl,用10 U Rsa Ⅰ、8 U Alu Ⅰ于37℃酶切3 h。酶切反應終止的產物經8%聚丙烯酰胺電泳凝膠電泳,再進行溴化乙啶(EB)染色,用DNA標準物的片段長度作為參照,燈光下觀察結果和拍色帶照片。
1.4統計處理 使用SSPS16.0軟件進行t、χ2檢驗。
2.1超聲骨質密度測量結果 NECO組骨質密度正常379例(61.2%),PMOP 240例(38.8%)。ECO組骨質密度正常419例(70.1%),PMOP 179例(29.9%)。兩組PMOP發病率差異有統計學意義(P<0.05)。
2.2ER-β 基因型多態性分析 ER基因多態性采用Rsa Ⅰ酶進行酶切可以區分出3個基因型:rr基因型(終產物為156 bp的1個條帶),Rr基因型(終產物為156、125 bp的2個條帶),RR基因型(終產物為125 bp的1個條帶),見圖1;采用Alu Ⅰ酶進行酶切可以區分出3個基因型:aa基因型(307 bp),Aa基因型(307、240、67 bp的3個條帶),AA基因型(240、67 bp的2個條帶),見圖2。
圖1 ER-β Rsa Ⅰ酶切基因多態性的凝膠電泳圖譜
圖2 ER-β Alu Ⅰ酶切基因多態性的凝膠電泳圖譜
2.3正常組與PMOP組ER-β基因多態性比較 兩組ER-β的RsaⅠ酶切rr基因型頻率差異有統計學意義(P<0.05)。兩組ER-β AluⅠ酶切基因型頻率差異無統計學意義(P>0.05),見表2。
2.4ER-β Rsa Ⅰ酶切基因型多態性在ECO PMOP組與NECO PMOP組的分布比較 ECO PMOP組與NECO PMOP組 RR、Rr 和rr基因頻率分布差異無統計學意義(P>0.05),見表3。
2.5ER-β AluⅠ酶切基因型多態性在NECO PMOP組與ECO PMOP組的分布比較 ECO PMOP組攜帶Aa基因型頻率分布明顯少于NECO PMOP組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。
表2 正常組和PMOP組ER-β RsaⅠ、ER-β Alu Ⅰ酶切基因型多態性分布比較〔n(%)〕
與對照組比較:1)P<0.01
表3 NECO組和ECO組ER-β Rsa I酶切基因型多態性分布比較〔n(%)〕
表4 NECO PMOP組和ECO PMOP組ER-β XbaⅠ酶切基因型頻率多態性分布比較〔n(%)〕
與ECO PMOP組比較:1)P<0.05
流行病學調查證實OP具有較強的遺傳性〔3〕,近年研究表明ER-β是OP密切相關基因之一〔4〕。Schuit等〔5〕研究說明ER-β基因多態性影響絕經后婦女雌激素表達水平,而絕經后婦女雌激素水平高低個體間有很大差異,在PMOP發生病理上起到決定性作用,因為雌激素可以促進成骨細胞形成骨質,而抑制破骨細胞對骨質溶解吸收,因此,ER-β基因的遺傳變異與PMOP密切相關。女性激素包括雌激素和孕激素,替代療法一般效果良好,但存在不良反應特別是治療后的并發癥,如乳腺癌和子宮內膜癌等。實驗證實植物性雌激素在體內有雙向調節作用〔6〕。當體內雌二醇處于較低水平時,進入體內植物性雌激素可以轉化高活性雌激素發揮雌激素樣作用,當體內雌二醇處于較高水平時,進入體內植物性雌激素與受體相結合時起到抑制效應。山茶籽油內含的植物性雌激素對PMOP的實驗動物模型療效明顯〔1,7〕。
本研究結果表明,長期ECO有防治PMOP的作用,rr基因型更易患PMOP,帶有這種基因型婦女要提前做好PMOP的防治。Aa基因型是與山茶籽油起交互作用對PMOP有防治作用的敏感基因。內含這種基因的絕經婦女ECO對PMOP的防治效果最好。
4 參考文獻
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