NOX-4調控PI3K信號通路參與TGF-β1誘導肺癌細胞表達I型膠原蛋白*

董 年，余埡妮，吳登敏，王蓓蓓，應趙建，裘丹萍，董 莉，陳成水

(溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科， 浙江 溫州 325000)

腫瘤微環境由間質細胞和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)共同構成，在腫瘤的免疫逃避、浸潤轉移和化療耐藥等惡性生物學行為方面發揮了重要作用,是肺癌5年生存率居高不下的原因之一[1]。目前肺癌的腫瘤微環境中細胞外基質膠原蛋白和纖連蛋白異常沉積的調控機制尚未闡明。既往研究認為腫瘤微環境中間質細胞尤其是成纖維細胞的活化是ECM異常沉積的中心環節，目前逐漸認識到肺癌細胞可以直接參與ECM的合成和分泌[2]。已知轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以經調控PI3K等信號通路參與腫瘤細胞ECM的合成分泌，深入研究TGF-β1調控PI3K信號通路的分子機制可以從腫瘤微環境的角度挖掘腫瘤防治的潛在靶點。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是一組具有氧化活性的蛋白，包括NOX-1、NOX-2、NOX-3和NOX-4等，主要經產生活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)參與細胞的增殖、分化和凋亡，并參與ECM合成和分泌等生物學功能[3]。研究報道NOX-4在肺癌組織中相較于癌旁組織過高表達，過高表達的NOX-4與腫瘤細胞的侵襲轉移等惡性生物學行為密切相關[4]，然而關于其在惡性肺癌細胞ECM異常分泌的機制尚未闡明。結合我們之前的研究發現脂酰肌醇3-激酶(phosphatylinositol 3-kinase，PI3K)家族PIK3CD亞基的異常表達和PI3K信號通路的過度激活與ECM異常沉積密切相關[5-6]，本研究擬在研究NOX-4是否參與TGF-β1誘導肺癌細胞 I型膠原蛋白(collagen type I, collagen I)表達的基礎上，深入探討NOX-4是否調控PIK3CD的表達和PI3K信號通路的活化以尋找TGF-β1/PI3K軸潛在的中介蛋白，為肺癌ECM異常沉積揭示潛在靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞

人肺癌細胞株A549購于上海中科院細胞庫。

2 主要試劑

RPMI-1640培養基和胎牛血清購自Gibco；人重組TGF-β1購自PeproTech；NOX-4抑制劑二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium, DPI)購自Sigma；BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白Marker和ECL 發光液購自Thermo；兔抗人p-Akt和Akt單抗購自CST；兔抗人NOX-4和collagen I單抗購自Abcam；TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；其它生化試劑購自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司設計合成，見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

3 方法

3.1細胞培養 A549細胞株使用包含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。

3.2細胞干預 取生長狀態良好處于對數生長期的細胞，接種于12孔板(抽提RNA)和6孔板(抽提蛋白)，待細胞長至孔板面積80%時，進行分組干預，每個分組設立3個復孔，每個實驗重復3次。

3.3Real-time PCR實驗 按照TRIzol說明書提取細胞總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進行real-time PCR實驗。PCR反應條件為95 ℃10 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環。結果以GAPDH為內參照，對目的基因進行相對定量，用2-ΔΔCt法計算。

3.4Western blot實驗 收集各組細胞，提取總蛋白，BCA測蛋白濃度。每組取30 μg蛋白行SDS-PAGE，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， I抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min，II抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min，ECL化學發光法顯影。以GAPDH為內參照，結果以各蛋白與GAPDH灰度值比值表示。

4 統計學處理

使用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。數據均以均數±標準差(mean±SD)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TGF-β1誘導肺癌細胞中NOX-4和collagen I的表達

選取5 μg/L的TGF-β1刺激A549細胞，于不同時點檢測NOX家族和collagen家族的mRNA表達；根據real-time PCR結果，選取不同濃度的TGF-β1刺激A549 細胞48 h，Western blot法檢測Nox-4和collagen I蛋白的表達。結果顯示TGF-β1可以誘導NOX家族中的NOX-4和collagen家族中的collagen I的表達，呈濃度和時間依賴性升高，其中5 μg/L TGF-β1是最適刺激濃度，TGF-β1刺激48 h后collagen I升高最為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of NOX-4 and collagen I in A549 cells induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of NOX family and collagen family induced by TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time; B: the protein level of NOX-4 and collagenⅠchanged by the vehicle and TGF-β1 at different doses for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group;△P<0.05;△△P<0.01vs0 μg/L group.

圖1TGF-β1誘導肺癌細胞中NOX-4和collagenI的表達

2 抑制NOX-4部分逆轉TGF-β1誘導的collagen I表達升高

使用不同濃度的NOX-4抑制劑DPI預處理A549細胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激48 h，real-time PCR和Western blot結果可見NOX-4抑制劑DPI可以部分逆轉TGF-β1誘導的A549細胞中collagen I的表達(P<0.05)，見圖2。

3 TGF-β1誘導PI3K 催化亞基PI3KCD表達和PI3K信號通路活化

選取5 μg/L濃度的TGF-β1刺激A549細胞不同時間，Western blot法檢測發現TGF-β1可以激活PI3K信號通路，呈現時間依賴性,見圖3A; real-time PCR檢測發現TGF-β1誘導PIK3 class I亞基中PIK3CD的表達，呈現時間依賴性,見圖3B。

Figure 2. Inhibition of NOX-4 blocked TGF-β1-induced expression of collagen I. A: the mRNA expression of collagen I was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at different doses with TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h; B: the protein level of collagen I was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L with TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsTGF-β1 group.

圖2抑制NOX-4部分逆轉TGF-β1誘導的collagenI表達升高

Figure 3. TGF-β1 induced PI3K/Akt signaling pathway activation and up-regulated the expression of PIK3CD. A: the protein levels of Akt and p-Akt challenged with TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time; B: the mRNA of PIK3 class I catalytic subunits induced by TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3TGF-β1誘導PI3K催化亞基PIK3CD表達和PI3K信號通路活化

4 抑制NOX-4降低TGF-β1誘導PI3K信號通路的活化程度

選取適宜濃度(5 μmol/L)的NOX-4抑制劑DPI預先處理A549細胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激不同時間，real-time PCR和Western blot檢測PIK3CD亞基和PI3K信號通路活化情況。結果所示,抑制NOX-4并不影響TGF-β1誘導的PIK3CD表達，但可以干擾TGF-β1活化PI3K信號通路，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

討 論

既往認為腫瘤微環境中間質細胞尤其是成纖維細胞的活化是ECM異常沉積的中心環節[7]，NADPH氧化酶與ECM異常沉積的相關研究主要集中在成纖維細胞。Tobar等[8]報道JNK信號通路調控NOX-4來源的ROS參與乳腺癌基質細胞的成纖維細胞樣分化和腫瘤纖維化生;類似的是，Hanley等[9]發現抑制NOX-4可以降低腫瘤間質中肌成纖維細胞表型的間質細胞比例。不同于之前研究聚焦于間質細胞,我們選取了TGF-β1誘導肺癌細胞表達 collagen I的細胞模型來模擬肺癌細胞分泌胞外基質的病理生理過程，發現TGF-β1在誘導collagen I表達的同時伴隨NOX-4的過高表達，而抑制NOX-4部分逆轉TGF-β1誘導的collagen I表達升高，說明NOX-4可能參與TGF-β1誘導肺癌細胞 collagen I表達。與我們的研究類似，Hiraga等[10]報道NOX-4參與TGF-β1誘導胰腺腫瘤的上皮間質變過程。

Figure 4. Inhibition of NOX-4 attenuated TGF-β1-induced PI3K signaling pathway activation. A: the mRNA of PIK3CD was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L and TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h; B: the protein levels of Akt and p-Akt challenged with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L and TGF-β1 (5 μg/L) for 30 min. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsTGF-β1 group.

圖4抑制NOX-4降低TGF-β1誘導PI3K信號通路的活化程度

TGF-β1是公認的促纖維化因子，主要經經典的Smad信號通路和非經典Smad信號通路介導ECM中collagen和纖連蛋白(fibronectin)等蛋白的合成分泌[11],其中非經典Smad通路PI3K信號通路是研究熱點，已有研究報道抑制NOX-4后胰腺癌細胞經調控PI3K信號通路促進細胞自噬[12]。無論是PI3K class I催化亞基(包括PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG)的異常表達還是PI3K信號通路的過度激活皆與胞外基質的合成分泌密切相關[5-6]，是否NOX-4可以經影響PI3K相關途徑逆轉TGF-β1誘導的collagen I表達？我們發現TGF-β1在誘導肺癌細胞collagen I表達的同時可以誘導PIK3CD的表達和PI3K信號通路的活化，而抑制NOX-4并不影響TGF-β1誘導的PIK3CD表達卻可以降低TGF-β1誘導PI3K信號通路的活化程度，說明NOX-4主要經影響PI3K信號通路的活化參與collagen I的表達調控。與此同時Zhang等[13]發現過表達NOX-4可以顯著促進PI3K信號通路活化，而抑制PI3K信號通路可以降低NOX-4的表達。以上研究不僅從正反兩面論證了NOX-4是PI3K信號通路活化的中介蛋白，而且揭示NOX-4和PI3K信號通路之間的正向反饋作用共同促進了肺癌細胞的增殖、遷徙和ECM合成、分泌。

雖然我們研究初步揭示了NOX-4調控PI3K信號通路參與TGF-β1誘導肺癌細胞表達collagen I的分子機制，然而研究尚存不足。首先，NOX-4屬于NADPH氧化酶家族，主要經釋放ROS發揮病理生理作用[14]，本研究中并未闡明TGF-β1/NOX-4/ROS/PI3K軸之間的直接線性關系；其次，NOX-4可以激活Ras/ERK、JNK以及PI3K等眾多信號通路[15]，抑制NOX-4部分逆轉TGF-β1誘導的collagen I表達升高并不是簡單的經降低TGF-β1誘導PI3K信號通路的活化程度，以后的研究勢必聚焦多條信號通路之間的協同/拮抗作用；然后，我們研究中僅僅選取了一個代表性的肺癌細胞系，考慮到實驗的可靠性，以后勢必要在多種肺癌細胞系進行驗證。

總而言之，我們研究發現NOX-4調控PI3K信號通路參與TGF-β1誘導肺癌細胞表達collagen I，初步闡述了TGF-β1/NOX-4/PI3K軸在調控肺癌細胞collagen I表達中的分子機制，NOX-4中介蛋白可能是未來針對肺癌ECM過度沉積的干預靶點之一，從腫瘤微環境的視角為肺癌的防治提供新的思路。

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