人參皂苷Re、Rg2對α-葡萄糖苷酶的活性抑制

畢云楓，李娜，姜珊，王溪竹，鄭明珠，劉景圣

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

糖尿病患者除了血糖水平增高外，蛋白質、脂肪和碳水化合物的代謝紊亂等并發癥是這種慢性疾病最常見的綜合征[1]。目前，糖尿病也是人類最重要的健康問題之一[2]。降低餐后高血糖癥的最受歡迎的治療方法之一是抑制α-糖苷酶，這是糖代謝和消化的重要原因[3]。由腸溶消化酶（α-糖苷酶）消化的復合多糖以葡萄糖的形式降解[4]。人體吸收后，這些葡萄糖會滲入血液，致使餐后高血糖。因此，通過抑制α-糖苷酶來減緩各種多糖的消化被認為是糖尿病治愈的關鍵治療方法[5]。研究者發現使用含有多種多糖的天然產物可以降低餐后血糖濃度。在吸收和消化過程中可以通過抑制腸膜內的葡萄糖擴散來實現[6]。最近，使用沒有任何副作用的天然治療藥物更多應用于這種慢性疾病的治療[7]。由于天然產物的功效性及安全性，對天然產物衍生的α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究也日益增多。相關文獻總結了用于治療2型糖尿?。═ype 2 Diabetes－Mellitus，T2DM）的天然產物或醫療植物[8]，說明天然產物是α-葡萄糖苷酶抑制劑的豐富來源。

人參是一種Panax屬的多年生草本植物（Araliaceae family），也是一種高價值和受歡迎的藥用植物。在中國、美國、俄羅斯、日本以及韓國和加拿大等多個國家，人參被大量栽培。人參植物根系用于傳統東方醫學幾千年。其藥理學特性主要歸因于人參皂苷，不同人參皂苷的活性有所不同[9]。日本科學家早在20世紀20年代就已經證明了人參根皂苷對抗糖尿病有極大的作用。過去十幾年，人參及其組分在降血糖疾病中的研究有顯著增加。人參皂苷組分具有免疫調節和抗氧化活性，這也是其對高血糖疾病具有有效作用的決定因素。對人參皂苷的作用機理研究表明，它們確有降血壓、降血糖、抗疲勞等功效。此后，人參皂苷在降血糖的領域被廣泛研究。本文正是借鑒過往經驗，深入對人參皂苷Re、Rg2對α-糖苷酶的抑制作用加以研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

人參皂苷Re、Rg2，純度＞99%：吉林大學化學學院；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase 750 U/g）：美國 Sigma公司；阿卡波糖：四川綠葉寶光藥業有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖糖苷（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：上海寶曼生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋：上海新苗醫療器械制造有限公司；pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子天平（FA1004B）：上海佑科儀器儀表有限公司；紫外分光光度計（UV-1800）：Japan Kyoto。

2 方法

2.1 相關溶液的配制

2.1.1 磷酸鹽緩沖液

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：稱取磷酸二氫鈉1.94 g、磷酸氫二鈉1.92 g，用蒸餾水配制0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并調為pH6.8，用微孔濾膜過濾，備用。

2.1.2 配制α-葡萄糖苷酶溶液

將凍干酶粉用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解，配置成6 U/mL的溶液。再將酶液分別稀釋配制成 0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 U/mL 的酶溶液，冷凍備用。

2.1.3 配制底物PNPG溶液

精確稱取0.3766 g PNPG，加入適量0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解，再用容量瓶準確定容到50 mL，配制成250 mmol/L的母液，將母液分別稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mmol/L 不同梯度的標準品溶液，備用。

2.2 確定反應體系

2.2.1 最佳酶液體積

在反應體系中分別加入α-葡萄糖苷酶酶液（0.3 U/mL）0、10、20、30、40 μL 反應 15 min 后，在波長405 nm下用紫外分光光度計測吸光度，決定酶液體積對葡萄糖生成量的影響，確定最佳加酶量。

2.2.2 反應時間的確定

在反應體系中加入酶液后，分別在 5、7、9、11、13、15、17 min后用紫外分光光度計測吸光度，確定反應的最佳時間。

2.2.3 做標準曲線

用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）配制為濃度1000 μmol/L的對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP），并稀釋成 400、300、200、150、100、50、0 μmol/L 7 種不同的濃度，將不同濃度的PNP各取160 μL，加入80 μL Na2CO3（0.2 mol/L）混勻，在405 nm下用紫外分光光度計測吸光度OD1，測量3組平行試驗后取平均值。將吸光度值OD作為縱坐標，對硝基苯酚濃度作為橫坐標，繪制曲線。

酶活力單位定義：pH6.8、3℃的條件下，每分鐘水解底物所產生的1 μmol對硝基苯酚所需的酶量，定義為1個酶活力單位（U）。

2.2.4 α-葡萄糖苷酶的活力測定

110 μL 磷酸鹽緩沖液（pH6.8），加入 30 μL α-葡萄糖苷酶（0.3 U/mL）和1%的DMSO 8 μL放在37℃10 min（恒溫）的條件下反應后，加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L）放在37℃溫度下繼續反應10 min，最后加入Na2CO3（0.2 mol/L）80 μL終止反應，在波長405 nm下測吸光度OD2。做3組平行試驗。

2.2.5 酶活性抑制率及計算

阿卡波糖的抑制：110 μL磷酸鹽緩沖液（pH6.8），加入 30 μL α-葡萄糖苷酶（0.3 U/mL）、1%的 DMSO 8 μL和50 μL不同濃度的抑制劑，放在37℃10 min（恒溫）的條件下反應后，加入 20 μL PNPG（2.5 mmol/L）放在37℃溫度下繼續反應10 min，最后加入Na2CO3（0.2 mol/L）80 μL終止反應，在波長405 nm下測吸光度OD3。做3組平行試驗。

Re、Rg2的抑制：110 μL 磷酸鹽緩沖液（pH6.8），加入 30 μL α-葡萄糖苷酶（0.3 U/mL）、1%的 DMSO 8 μL和50 μL不同濃度的抑制劑，放在37℃10 min（恒溫）的條件下反應后，加入 20 μL PNPG（2.5 mmol/L）放在37℃溫度下繼續反應10 min，最后加入Na2CO3（0.2 mol/L）80 μL終止反應，在吸光度405 nm下測吸光值OD4。做3組平行試驗。

空白組為①磷酸鹽緩沖液＋酶：用緩沖溶液補足到反應體積，測吸光度OD1。做3組平行試驗；②磷酸鹽緩沖液+抑制劑+酶：用緩沖溶液補足到反應體積，測吸光度OD3。做3組平行試驗。

3 結果與討論

3.1 標準曲線

用不同濃度的PNP進行反應，做出標準曲線，見圖1。

圖1 對硝基苯酚光密度標準曲線Fig.1 Standard curve of optical density of p-nitrophenol

3.2 確定α-葡萄糖苷酶酶量對反應體系的影響

在以PNPG為底物與α-葡萄糖苷酶進行的反應體系中，最終測得PNP分解量的吸光度值隨著酶量的增加而增大，這可以表現出α-葡萄糖苷酶的活性。在其他組分濃度不變的條件下，酶量越大反應速度越快，當酶濃度為0.3 U/mL，體積為30 μL時，酶量與反應產物呈現良好的線性反應關系，結果如圖2所示。

圖2 酶量對反應體系的影響Fig.2 Effect of enzyme volume on the reaction system

最終反應體系選定為酶量30 μL進行酶活性的測定。

3.3 反應時間對反應體系的影響

反應時間對反應體系的影響如圖3所示。

在反應體系進行時，從第5分鐘開始每隔2分鐘測一下吸光度，當反應時間達到15 min時，吸光度值出現了平衡期，數值不再上升，因此我們判定反應體系的最佳時間即為10 min。

3.4 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的活性抑制

阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的活性抑制見圖4。

圖3 反應時間對反應體系的影響Fig.3 Effect of reaction time on the reaction system

圖4 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的活性抑制Fig.4 Acaconose inhibition of α-glucosidase activity

采用不同濃度的阿卡波糖進行反應，其對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用呈現出良好的劑量關系，抑制曲線與阿卡波糖濃度成正比，尤其當濃度在2mg/mL～8 mg/mL的區間內，抑制率明顯隨著濃度增大而增大。

因此可以判斷本實驗體系符合α-葡萄糖苷酶體外抑制模型符合此次大規模的篩選需要。

3.5 不同濃度的人參皂苷Re、Rg2對α-葡萄糖苷酶的活性抑制

測量不同濃度的人參皂苷Re、Rg2對α-葡萄糖苷酶的活性抑制，以人參皂苷Re、Rg2濃度（mg/mL）為橫坐標，抑制率（%）為縱坐標，繪制的曲線，結果如圖5、圖6所示。

圖5 人參皂苷Re對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.5 Inhibition curve of ginseng extract Re on α-glucosidase

圖6 人參皂苷Rg2對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.6 Inhibition curve of ginseng extract Rg2on α-glucosidase

當濃度在2 mg/mL～8 mg/mL時，人參皂苷Re、Rg2對α-葡萄糖苷酶的活性抑制有著良好的量效關系，抑制曲線與皂苷濃度成正比。這兩種人參皂苷均對α-葡萄糖苷酶的活性有明顯抑制作用，當濃度較低時，Re對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率要比Rg2高，反之，則Rg2對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率要比Re高，然而同陽性對照阿卡波糖相比較，這兩種人參皂苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用都有所不及。

4 結論

隨著社會的發展、進步，人類生活水平的日益提升，T2DM的患病率不可避免的與日俱增。T2DM具體特征表現為胰島素抵抗和胰腺β細胞功能障礙，且是一種復雜的異種多發性疾病。由于胰腺β細胞的死亡或功能的喪失，會引起餐后胰島素分泌受損，致使高血糖且隨后胰島素敏感性下降。因此，迫切需要更好的治療方法和T2DM的新型預防策略。為解決這一難題，科研人員開始建立適當的體內和體外模型。迄今為止，一些實驗模型可用于研究T2DM，然而，通過調整現有方法或通過開發新方法或兩者的組合，來繼續追求建立T2DM更好實驗模型是更好的途徑。雖然有個別幾種藥物對治療糖尿病有很好的療效，但都具有極大的副作用或不良反應。因此，近些年大量研究人員開始尋求天然產物或飲食干預來預防或治療T2DM。數千年來，隨著醫學實踐，中醫藥傳統醫學系統積累了大量寶貴的經驗。截至目前，人參成為了治療糖尿病最有效替代藥物之一。人參在我國是特有的一種珍貴藥材，幾千年來食用人參的傳統一直得以延續。而糖尿病可以導致各種各樣的疾病及代謝紊亂，是一種頑固的疾病且在全球年發病率一直持續增加[10]。在人體中，葡萄糖耐受作用在高血壓發生之前即受到抑制[11-12]，廣泛用作檢測糖尿病的臨床指標。人參的藥理作用主要歸因于人參皂甙，主要分為原人參二醇型人參皂苷（protopanaxdiolcas，PDG），如人參皂甙 Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg3和 Rh2以及原人參三醇型人參皂甙（protopanaxatriol，PTG），如人參皂苷 Rg1。PDG 組中的糖部分連接到C-3位，而PTG基團連接在C-6位上。以前的大量研究已經可以證明人參皂苷Rb1對降血糖具有良好的作用。而本試驗則是首次利用人參皂苷Re、Rg2進行的體外實驗，并且通過數據結果顯示，最終達到了預期效果。

酶活性的影響因素有很多，為了有一個良好的反應體系，此試驗優化了酶量和反應時間。結果表明，酶量用30 μL，反應時間10 min為最佳狀態，這其中不足之處就是人參皂苷Re、Rg2的最大溶解度是8 mg/mL，否則將會有更好的抑制效果。人參皂苷能有效抑制α-葡萄糖苷酶的體外活性，由于體內抑制和體外抑制兩者之間具有很大差異，所以還需進行體內實驗，進一步通過體內模型來研究人參皂苷的抑制效果，并提供一些體內降血糖的理論依據。

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