響應面法優化紅薯葉中綠原酸的提取工藝及動力學分析

何春玫，梁宇寧，項有泳

（1.廣西農業職業技術學院，廣西南寧530007；2.廣西師范大學，廣西桂林541004；3.防城港市廣源農業開發有限公司，廣西防城港538100）

紅薯又稱為甘薯、蕃薯、地瓜等，是我國主要糧食作物之一。廣西紅薯種植面積一直穩定在26.7萬hm2左右，近年來，由于技術推廣和品種更新，年產量達600萬t，產值以每年5%的速度增加[1]，紅薯葉資源十分豐富。

綠原酸對人體具有清除自由基、抗菌消炎、利膽清熱等作用，是許多中草藥的有效藥理成分之一[2]。當前，國內有學者研究了從金銀花、杜仲、牛蒡、紅薯葉根等植物中提取綠原酸[3-10]，文獻多集中于對不同提取工藝的優化，關于綠原酸提取動力學研究的報道較少。本試驗在前人研究的基礎上，以烘干的廣西東興市紅姑娘紅薯葉為原料，采用乙醇浸提法，通過Box-Behnken設計試驗，優化提取工藝，并對提取過程建立動力學模型，為進一步利用紅薯葉提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

東興市紅姑娘紅薯葉：由防城港市廣源農業開發有限公司紅姑娘紅薯種植示范基地提供。

1.1.2 主要試劑

綠原酸標準品：合肥博美生物科技有限責任公司；無水乙醇、石油醚、鹽酸（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DH-400S型電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫療器械有限公司；800B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；JP-1000B多功能粉碎機：永康市久品工貿有限公司；VIS-722型可見光分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸標準曲線的繪制

準確稱取綠原酸標準品2.5 mg，以適量無水乙醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，得綠原酸標準溶液。準確吸取 0、1、2、3、4、5 mL 上述標準液，用無水乙醇稀釋并定容至25 mL，所得綠原酸系列工作液分別相當于0、4、8、12、16、20 μg/mL 的綠原酸標準液。在 200 nm～400 nm波長下對綠原酸標液進行掃描，在328 nm處出現最大吸收波長。以無水乙醇為參比，測標準系列的A328，以吸光度A328為縱坐標、綠原酸濃度為橫坐標繪制標準曲線并擬合回歸方程，如圖1所示。

圖1 綠原酸標準曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

由圖1可見，綠原酸濃度在0～20 μg/mL范圍內與A328值呈現良好的線性關系。

1.2.2 綠原酸的提取工藝及提取率的計算

將新鮮的紅薯葉洗凈晾干后，于60℃烘干，粉碎過40目篩，備用。準確稱取1.0 g紅薯葉粉，石油醚處理去除色素等雜質，離心，沉淀按料液比1∶20（g/mL）加入乙醇溶液，加HCl溶液調整溶液pH值，在一定的溫度下，回流提取一定時間，抽濾，定容至200 mL。取提取液1.00 mL稀釋至10 mL，以無水乙醇為參比，測定樣品溶液的吸光度A328，根據1.2.1回歸方程計算綠原酸濃度C，提取率。

式中：C為綠原酸濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數；m為紅薯葉粉質量，g。

1.2.3 綠原酸提取工藝優化設計

通過查閱文獻資料發現，影響醇提紅薯葉綠原酸的因素有前處理方法、乙醇濃度、pH值、提取溫度、提取時間、料液比等[2，6-9]，其中乙醇濃度、pH 值、提取溫度、提取時間對提取率的影響較顯著，擬固定料液比1∶20（g/mL），通過單因素試驗考察乙醇濃度、pH值、提取溫度、提取時間的影響水平，利用Design Expert 8.0軟件進行Box-Behnken響應面優化試驗方案設計，響應面試驗因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.4 綠原酸提取過程動力學分析

利用Origin Pro 8.0軟件對試驗數據進行模型擬合，并以Reduced Chi2、R2和Adj-R23個參數以及離散比較圖評價數學模型的擬合程度。Reduced Chi2表示數據與擬合曲線的偏離程度；R2表示決定系數平方；Adj-R2為校正決定系數平方。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響

調整溶液pH值為5，提取溫度為60℃，提取時間為30 min，用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液提取綠原酸，測定綠原酸提取率，結果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖2可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨乙醇濃度的增加呈現先增大后減小的趨勢，當乙醇濃度達60%時，綠原酸的提取率較高，超過60%后綠原酸的提取率略有下降，原因可能是濃度較大的乙醇溶液會加大溶出一些醇溶性雜質，這些物質競爭乙醇從而影響了綠原酸的溶出。因此后續試驗選擇乙醇濃度為60%。

2.1.2 溶液pH值對綠原酸提取率的影響

選擇乙醇濃度為60%，提取溫度為60℃，提取時間為 30 min，分別調整溶液 pH 值為 1、3、5、7、9 的乙醇溶液提取綠原酸，測定綠原酸提取率，結果如圖3所示。

圖3 溶液pH值對綠原酸提取率的影響Fig.3 Effects of pH on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖3可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨溶液pH值的增加呈現先略增加后快速減小的趨勢，當溶液pH值為3～5時，提取率基本穩定，提取效果相當，隨后提取率下降較快，原因可能是綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸組成的一類縮酚酸[10]，溶液pH值較大會加快綠原酸的水解而使提取率下降。因此，后續試驗選擇溶液pH值為5。

2.1.3 提取溫度對綠原酸提取率的影響

固定乙醇濃度為60%，溶液pH值為5，提取時間為 30 min，選取提取溫度分別為 20、40、60、80、100 ℃，測定綠原酸提取率，結果如圖4所示。

由圖4可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨提取溫度的增加呈現先略增大后快速減小的趨勢。60℃左右，提取率較高，當溫度高于60℃，隨著提取溫度的升高，因高溫破壞綠原酸，使得提取率下降較快。因此，后續試驗選擇提取溫度為60℃。

圖4 提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the extraction yield of chlorogenic acid

2.1.4 提取時間對綠原酸提取率的影響

固定乙醇濃度為60%，溶液pH值為5，提取溫度為 60 ℃，選取提取時間分別為 10、20、30、40、50 min，測定綠原酸提取率，結果如圖5所示。

圖5 提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effects of extraction time on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖5可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨提取時間的增加呈現先增大后趨于穩定的趨勢。提取時間30 min～50 min左右，提取率基本穩定，提取效果相當，因此，后續試驗選擇提取時間為30 min。

2.2 Box-Behnken試驗設計及顯著性分析

根據單因素試驗結果，選擇乙醇濃度、pH值、提取溫度、提取時間4個因素的3個較優水平，采用Design Expert8.0軟件進行Box-Behnken響應面優化試驗方案，以綠原酸提取率作為響應值，確定提取最佳工藝條件。響應面試驗方案與結果見表2。

表2 響應面試驗方案與結果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

續表2 響應面試驗方案與結果Continue table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

對表2數據進行回歸擬合，可得響應變量A、B、C、D對提取率（Y）的回歸方程為：

利用Design Expert8.0軟件對表2數據進行二次響應模型方差分析，結果如表3如示。

經分析，回歸模型的決定系數R2=0.9573，P＜0.0001，說明模型極顯著；失擬項P=0.2755，影響不顯著，說明非試驗因素對試驗結果影響不大；模型校正決定系數R2Adj=0.9147，表示可以用此數學模型解釋91.47%的變異性；變異系數C.V%=0.88，說明該回歸模型可信度較高；精密度值=17.01＞4，說明該模型合理，可應用該模型預測和分析紅薯葉綠原酸的提取條件。根據表3可知，各因素對紅薯葉綠原酸提取率的影響大小順序為：pH值＞提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間，其中pH值和提取溫度的影響極顯著（P＜0.01），乙醇濃度影響顯著（P＜0.05）。

2.3 各因素間交互作用分析

根據表3可見，影響因素之間A（乙醇濃度）與B（溶液pH值）、A（乙醇濃度）與C（提取溫度）的交互影響極顯著（P＜0.01），B（溶液 pH 值）與C（提取溫度）的交互影響顯著（P＜0.05），其他因素之間的交互作用不顯著。利用回歸模型作各因素間響應面圖和等高線圖如圖6所示。

表3 二次響應模型方差分析結果Table 3 ANOVA results of the fitted quadratic regression model

圖6 各因素間交互作用的等高線圖和響應面圖Fig.6 Response surface and contour plots

由圖6可見，以上響應面圖均為開口向下的平滑曲面，曲面上存在最大響應值。綜合各等高線圖發現，沿溶液pH值方向的曲線較密集，可見溶液pH值的變化對響應值的影響較其他因素大。

2.4 最佳工藝條件確定

采用Design-Expert 8.0軟件進行分析計算，得出提取紅薯葉綠原酸最佳工藝條件為：乙醇濃度59%，溶液pH4.8，提取溫度57℃，提取時間29 min，提取率預測值為3.63%。為檢驗工藝參數的準確性，為方便試驗操作，選擇乙醇濃度60%，溶液pH4.8，提取溫度55℃，提取時間29 min，平行3次試驗，測得綠原酸提取率為3.597%，相差為-0.91%，說明本回歸模型具有可靠性。

2.5 綠原酸提取的動力學分析

2.5.1 動力學數學模型的建立

由表3可見，溶液pH值對綠原酸提取率的影響極顯著，本試驗固定乙醇濃度為60%和提取溫度60℃，建立動力學數學模型分析不同溶液pH值隨提取時間變化對綠原酸提取率的影響，考察不同溶液pH值下綠原酸的提取率隨提取時間的變化規律。結果如圖7所示。

圖7 溶液pH值、提取時間與綠原酸提取率的關系Fig.7 Relationship between pH，extraction time and extraction rate of chlorogenic acid

由圖7可見，溶液pH值不同，綠原酸的最大提取率不同，溶液pH值過大或過小都會影響綠原酸的提取。溶液pH值較大會加快綠原酸的水解而使提取率下降，溶液pH值較小會影響綠原酸從植物細胞中溶出而影響提取率。綠原酸溶出在溶劑后，由于自身穩定性較弱，隨著時間的延長會略有分解而使提取率下降。

由圖7可見，溶液pH值對綠原酸提取率的影響過程符合多項式模型，采用OriginPro 8.0軟件的多項式函數對圖7的試驗數據進行模型擬合，結果如表4～表7。

R2又稱為擬合優度，當它越接近1時，表示擬合模型的方程式參考價值越高。Adj-R2調整了由于參數個數帶來的相關性計算誤差，它的值越接近1越準確地評價回歸方程的優劣。Reduced Chi2表示數據與擬合曲線的偏離程度，它的值越小說明數據越接近擬合曲線。由表4～表7可見，采用多項式函數可以很好地進行數據擬合，當多項式次數達5以上，R2達0.96以上，Adj-R2達0.93以上。

2.5.2 動力學數學模型考察

為驗證所建立的動力學模型，分別計算4、5、6、7次多項式模型的擬合點，考察擬合數據對擬合方程的離散情況，結果如圖8所示。

表4 不同溶液pH值的提取動力學模型4次多項式擬合參數表Table 4 4 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

表5 不同溶液pH值的提取動力學模型5次多項式擬合參數表Table 5 5 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

表6 不同溶液pH值的提取動力學模型6次多項式擬合參數表Table 6 6 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

表7 不同溶液pH值的提取動力學模型7次多項式擬合參數表Table 7 7 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

圖8 數據對各擬合方程的離散情況Fig.8 The discretization of data to each fitting equation

圖8中，實線為試驗數據的擬合曲線，點為試驗數據點或擬合數據點。從圖8可見，除4次多項式擬合中pH5的試驗數據擬合曲線較差外，其余次數多項式中各試驗數據與模型的擬合程度都較高。但各次數多項式的擬合數據與模型的擬合程度又各不相同：在6次多項式擬合模型中，pH3、pH5的擬合數據點與擬合曲線偏離較大，在7次多項式擬合模型中，pH5、pH7的擬合數據點與擬合曲線偏離較大，說明所建立6次、7次多項式模型并不理想，模型公式對計算結果產生了較大的影響?？梢娊⒍囗検侥Ｐ椭?，5次多項式模型更能反映紅薯葉中綠原酸提取過程的動力學規律。

3 結論

本試驗以烘干的東興紅姑娘紅薯葉為原料，采用乙醇浸提法，以溶液pH值、乙醇濃度、提取溫度和提取時間作為試驗因素，通過單因素試驗和Box-Behnken設計試驗，研究了從烘干的紅薯葉粉提取綠原酸的最優工藝條件為：乙醇濃度59%，溶液pH4.8，提取溫度57℃，提取時間29 min，提取率預測值為3.63%。以不同溶液pH值下綠原酸提取率隨時間變化的規律建立了提取過程動力學模型，采用Origin－Pro8.0軟件的多項式函數對試驗數據進行模型擬合。經擬合模型比較，5次多項式模型更能反映紅薯葉中綠原酸提取過程的動力學規律。

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