奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂、YY♂）雜交子代的性比分析

萬松良 ，筴金華 ，任炳琛 ，魏志宇 ，張艷紅 ，萬珊

（1.湖北省水產研究所，湖北 武漢 430071；2.河北中捷國家級羅非魚良種場，河北 滄州 061108；3.湖北省獸藥監察所，湖北 武漢 430070）

羅非魚種間存在雌性同形配子、雄性異形配子（XX♀/XY♂）和雌性異形配子、雄性同形配子（WZ♀/ZZ♂）等兩種性別決定類型。已知莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambicus和尼羅羅非魚O.niloticus屬于前一類型，奧利亞羅非魚O.aureus和荷那龍羅非魚O.hornorum屬于后一類型[1]。以往大量雜交實驗證實，將某些不同性別決定機制的羅非魚種間雜交，配子同型的XX型雌魚與ZZ型雄魚正交，可獲得全雄或高雄性率子代，即雌雄性比為0∶1；配子異型的WZ型雌魚與XY型雄魚反交，雜交子代的雄性率一般為75%左右，即雌雄性比為1∶3[2]。但是，近年來，國內少數研究者對上述反交結果提出質疑，他們用WZ雌奧利亞羅非魚與XY、YY雄尼羅羅非魚雜交，其子代雌雄性比都為1∶1，故推斷其中WY型雜交羅非魚為雌性[3-5]。本研究在2010年至2014年測交篩選YY超雄尼羅羅非魚的同時，也開展了奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂、YY♂）測交實驗，以驗證WY型雜交羅非魚的性比，并為育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源

奧利亞羅非魚為中捷羅非魚良種場從無錫淡水漁業中心引進的“夏奧1號”良種；尼羅羅非魚系從上海海洋大學引進的第13代新吉富品系，其中YY超雄尼羅羅非魚系本課題組篩選獲得。

1.2 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂）雜交

根據孟德爾遺傳學定律，WZ雌性奧利亞羅非魚與XY雄性尼羅羅非魚交配，子代將產生WX、WY、ZX、ZY等4種性別基因型，各占1/4，其中WX♀、ZX♂、ZY♂為已知性別，WY型的性別由同窩子代雌雄性比來判斷，若性比為1∶1，則WY判斷為♀；若性比為1∶3，WY判斷為♂。

在兩口4m×2m×1.5m的水泥池中各放1尾體質量1.4～1.5kg的雄親魚，再分別放入體質量0.4～0.6kg的雌親魚7尾（105#池）和4尾（106#池）。每尾親本注射0.5個鯉腦垂體（PG）懸浮液催產。

本雜交父本為候選YY超雄魚的材料魚，在與奧利亞羅非魚雌魚交配見苗后，馬上又與XX型雌性尼羅羅非魚測交，用子代測試法驗證其性別基因型為YY♂還是XY♂。

1.3 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（YY♂）雜交

根據遺傳學原理，WZ雌奧利亞羅非魚與YY超雄尼羅羅非魚交配，子代只產生WY、ZY等兩種基因型，各占50%，其中ZY♂為確認的雜種超雄魚，WY型的性別可再由同窩雌雄性比來判斷。若性比為1∶1，則WY為♀；若性比為0∶N（N表示測交子代總數）[6]，即子代是全雄魚或高雄性率魚，WY為♂；若性比為1∶3，則WY仍為♂，但否定父本是YY♂，而是XY♂。

在池塘內兩口1.5m×1m×1m的32目網箱中，每箱放入測交篩選的、體質量1kg左右的YY超雄尼羅羅非魚1尾，其中5～26#箱配體質量0.4～0.6kg的雌奧利亞羅非魚2尾，5～27#箱配相似體質量的雌性奧利亞羅非魚1尾，未注射催產劑。剪去YY超雄魚的上頜，防止大個體雄魚咬傷小個體雌魚。各箱配組繁苗20d后，移走親本，將子代單獨飼養至性別鑒定。

YY超雄尼羅羅非魚性別基因型分子標記鑒定：為重復驗證用測交法篩選的YY超雄魚的準確性，后期剪取每尾YY超雄魚一小塊尾鰭樣品，裝進1.5mL的編號試管中，經脫水處理后，與其他尼羅羅非魚樣品一起，送西南大學水產實驗室作性別特異分子標記鑒定[7]，看兩種鑒定結果是否相吻合。

1.4 子代雌雄鑒別

雜交子代個體一般長到50g左右時，性別特征已完全分化。此時隨機撈取百尾以上樣本或全部樣本，逐尾觀察肛門之后有無產卵孔來辨別雌雄，統計性比。也對少數體長達到4cm以上的子代，隨機取出一部分，腹腔注射5%的冰醋酸固定液，解剖觀察性腺，鑒別雌雄。

1.5 數據處理分析

用卡方分析檢驗各組合子代雌雄性比實驗值與期望值的適合度，顯著水平為P＞0.05或P＜0.001。觀察所得的子代性別比例是否與期望值相吻合。

2 結果與分析

2.1 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂）雜交子代的性比

經7個半月的繁殖與飼養，兩池都獲得了大小兩批雜種子代魚，稱重測算105#池有1 413尾，106#池有2 132尾。各池隨機抽樣鑒別雌雄結果見表1。105#池鑒魚225尾，雄性率為49.3%，性比為1∶0.97。與1∶1的性比期望值作卡方分析，X2=0.018，P＞0.89，與期望值相吻合，由此判斷105#池的WY型魚為♀。106#池共鑒魚204尾，雄性率為80.4%，性比為1∶4.1。與1∶1的性比期望值作卡方分析，X2=74.16，P＜0.001，與該期望值有極顯著差異，而與1∶3 的期望值相吻合（X2=2.882，P＞0.089）。由此卡方分析判斷，106#池中的WY型魚應為♂。父本測交結果顯示，105#池中父本子代的雄性率為64%，106#池中父本子代的雄性率為54%，確證兩尾父本的性別基因型均為XY♂。

2.2 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（YY♂）雜交子代的性比

5-26#網箱繁殖雜交子代兩窩，獲苗較多，5-27#網箱只繁殖1窩，獲苗較少。飼養8個月后，5-26#箱共鑒魚506尾，雄性率為99.4%，雌雄性比1∶168（表2）。以雌雄比1∶1的期望值作卡方分析，X2=492.10，P＜0.001，與1∶1的期望值有極其顯著的差異，而與0∶N（N表示雜交子代的總數）的期望值相吻合（X2=0.0124，P=0.92）?？ǚ椒治鲎C明，本箱中的WY型魚為♂，父本為YY超雄魚。5-27#箱僅有子代魚20尾，雄性率為80%，雌雄性比1∶4。以雌雄性比1∶1的期望值作卡方分析，X2=6.05，P=0.0139，雖與1∶1的期望值有明顯差異，但未達到極顯著水平，而與1∶3的期望值相吻合（X2=0.067，P=0.80）?？ǚ椒治霰砻?，5-27#箱中的 WY型魚也為♂，但父本可能不是YY型超雄魚，而是XY型雄魚。后與性別基因分子標記鑒定結果對照，發現5-26#父本性別基因型確為YY，5-27#父本性別基因型則為XY，后者性別基因分子鑒定與雜交子代性比結果相吻合，但與之前測交篩選YY超雄魚（子代♀∶♂=5∶95，雄性率95%）的結果相矛盾。這就提示我們，盡管在測交過程中，子代抽樣達100尾，雄性率高達95%以上，父本仍有可能不是YY超雄魚。

為進一步驗證5-26#網箱中近乎全雄的F1代尼奧羅非魚中是否含有WY型雄魚，從中隨機取出少量性成熟個體，在網箱中與XX雌尼羅羅非魚作測交實驗。從理論上講，WY型雄魚與XX型雌魚測交的后代（WX♀，XY♂）性比為1∶1，雄性率在50%左右，而YZ型超雄魚與XX型雌魚測交的后代（XY♂，XZ♂）雄性率至少應在90%以上。配組9箱，產苗4箱，3個月后檢測F2代性比，除一口網箱的魚苗太小沒有鑒別外，其他3口網箱鑒別出兩尾F1代WY♂（表3）。少量測交結果充分證實，由YY超雄尼羅羅非魚與WZ雌性奧利亞羅非魚雜交的全雄子代中含有大批WY型雄魚，并非只是單純的YZ型超雄魚，直接證實了WY♂的存在。

表1 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂）雜交子代的性比Tab.1 The sex ratios of offsprings from blue tilapia Oreochromis aureus（WZ♀）×Nile tilapia O.niloticus（XY♂）crosses

表2 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（YY♂）雜交子代的性比Tab.2 The sex ratios of offsprings from blue tilapia Oreochromis aureus（WZ♀）×Nile tilapia O.niloticus（XY♂）crosses

表3 5～26網箱F1代雄性尼奧羅非魚與正常XX雌性尼羅魚測交后代的性比Tab.3 The sex ratios of offsprings from F1NO-tilapia male in cage 5～26 test crossed to normal XX female Nile tilapia O.niloticus

3 討論

3.1 WY型羅非魚的性別

綜觀以上4組實驗的測交結果，除1組子代雌雄性比顯示WY型羅非魚為♀外，其他3組子代性比都表明WY型羅非魚為♂。特別是YY超雄魚為父本的組合中，子代雌雄性比為3∶503，接近0∶N的理論比值，雄性率高達99.4%,充分證實WY型羅非魚的確為♂。用該組少量F1代尼奧全雄羅非魚與XX雌性尼羅羅非魚測交，也進一步證實了其中WY♂的客觀存在（表3）。這一結果與以前萬松良等[8]用YY超雄莫桑比克羅非魚作父本測交的結果完全相似。在以前研究中，筆者用3尾YY超雄莫桑比克羅非魚和3尾WZ雌性奧利亞羅非魚分別測交，獲得雜種子代800尾，一年性成熟后再逐尾檢查性別，結果無一尾雌魚，全部為雄性，雌雄性比為0∶800，完全符合0∶N的理論比值，證實WY型羅非魚為♂。

基于以上研究結果認為，在絕大多數情況下，將種質純正的WZ型奧利亞羅非魚雌魚與XY型、特別是YY型尼羅羅非魚或莫桑比克羅非魚雄魚雜交，所獲得子代雌雄性比為1∶3和0∶N，其中WY型羅非魚的性別肯定為♂。這些結果也支持了筆者以前研究提出的羅非魚4種配子性別基因強度順序為Y♂＞W♀＞Z♂＞X♀的觀念[8]。而少數研究者將4種配子性別基因強度順序（或顯隱性關系）修改為W♀＞Y♂＞Z♂＞X♀[4]，不符合大多數研究結果。

3.2 關于某些實驗值偏離理論期望值的原因分析

雖然上述絕大多數實驗獲得的子代雌雄性比實驗值都與1∶3和0∶N的理論期望值相吻合，但不可否認，本次實驗中畢竟有一組子代的雌雄性比實驗值為1∶1。而國內少數研究者（2012）用2尾XY♂和1尾YY♂尼羅羅非魚分別與10尾和11尾WZ♀奧利亞羅非魚測交實驗，所得的子代雌雄性比值都為1∶1[3]。這種少數雌雄性比實驗值偏離理論期望值的異?，F象不容忽視，其原因值得深入分析探究。

尼羅羅非魚是世界性養殖魚類，大范圍的推廣養殖難免來自其他種類的基因滲入尼羅羅非魚的基因組，造成種質不純，降低養殖性能[9]。大量生產實踐證實，兩種性別決定機制的羅非魚種間雜交，雜種后代的雄性率與親本種質純度密切相關，親本種質純度越高，雄性率也越高[10]，反之，親本種質純度降低，雄性率也降低。李思發等[11]研究指出，我國尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚養殖群體存在一定程度的遺傳漸滲，有些雜種羅非魚的外表酷似尼羅羅非魚，這種雜種同正宗尼羅羅非魚肉眼難以區分，誤被當作尼羅羅非魚而混入繁育群體。如果不純的尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚雜交，或者其雜交種混雜進了父母本群體，尼奧魚的雄性比將大幅降低，養殖性能降低?；谶@種遺傳漸滲理論推測，上述雜交子代雌雄性比實驗值偏離預期值，下降為1∶1的意外結果，很有可能是因參與雜交的尼羅羅非魚父本不純所致。這種父本外形似尼羅羅非魚，遺傳本質卻是奧利亞羅非魚，它的雜交后代雌雄性比為1∶1就不足為奇了。

決定羅非魚性別的遺傳學機制復雜[12]。有些子代性比結果僅用單因子性染色體遺傳或性配子決定理論解釋還不夠[13-16]。近期研究顯示，奧利亞羅非魚存在著兩對性染色體[17]。羅非魚的性別是以性別基因為主的多因子（如常染色體、親魚效應、環境等）共同作用來決定[18]。最近，Baroiller等[19]將尼羅羅非魚的性別決定機制重新歸納成三點：①主要由遺傳基因如性染色體主導；②某些次要因子如親代效應，以及③環境如溫度等因子共同引導性別。據此推測，以上少數雜交子代雌雄性比結果偏離預期值的原因，也可能與測交的父母本種群和個體的親代效應有關聯，即因雜交親代的種群或個體不同，影響到雜種后代的雌雄性比偏離預期值。以上推測都有待進一步研究證實。

3.3 關于建立WY♀-YY♂的超雄羅非魚自繁體系的可行性

本研究的初衷是想驗證WY♀雜種羅非魚是否客觀存在。若存在，就可構建免測交的WY♀-YY♂超雄羅非魚自繁體系。但本實驗證實由YY超雄尼羅羅非魚與WZ型奧利亞羅非魚雜交產生的WY型雜種羅非魚性別絕大多數不為♀，而為♂，因而也未完成構建WY♀-YY♂超雄羅非魚自繁體系。

如上分析，在親本種質不純或可能存在種群不同的親代效應的情況下，產生少數雜交后代的雌雄性比值偏離預期值的異?，F象，但它并不能代表正常情況下絕大多數WY型雜種羅非魚的性別為雄的遺傳本質。若以這少數異常結果來推斷絕大多數正常的WY型雜種羅非魚的性別，就會得出以偏概全的結論。少數研究者僅用一尾YY超雄魚作父本測交[3]，來推斷子代WY型雜種羅非魚為♀，其依據不夠充分，結論值得商榷。

尼羅羅非魚是羅非魚類中個體最大、生長最快的優良種類。從遺傳角度來說，即便WY型羅非魚性別為♀，但因它屬雜種，并不具備純種尼羅羅非魚的外形特征和生長優勢。它需與YY超雄尼羅羅非魚經過5代以上的回交和定向選種[4]，才能構建具有尼羅羅非魚外形特征和生長優勢的WY♀-YY♂型羅非魚繁殖體系，過程相當費時費力。WY♀-YY♂的性別決定機制在本質上與WZ♀-ZZ♂一樣，都是雌性異形配子和雄性同形配子，理論上并無創新。

綜上所棕，目前建立WY♀-YY♂型超雄羅非魚自繁體系是不可行的。而直接利用Y♂配子超強顯性優勢，將YY超雄尼羅羅非魚與WZ雌性奧利亞羅非魚雜交，生產具有全雄和雜種雙重優勢的奧尼羅非魚，對促進單雄性羅非魚養殖更具重大意義。

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