玉米赤霉烯酮降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

潘麗婷 徐圣佳 胡曉丹 徐麗梅 史建榮 顧振新 徐劍宏

(南京農業大學1，南京 210095) (江蘇省食品質量安全重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地；農業部農產品質量安全風險評估實驗室(南京)；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心; 江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所2，南京 210014)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又稱F-2毒素，是一種由鐮刀菌產生的類雌激素性質的真菌毒素，最早于1962年由Stob從患赤霉病的玉米中分離到[1]。ZEN在世界各地的谷物及農副產品中廣泛存在[2-4]。 2012年，王金勇等[5]對我國的飼料和谷物受ZEN污染水平的調查結果顯示，玉米中平均值為0.332 mg/L，最高值為1.961 mg/L；DDSG(酒糟蛋白)飼料中平均值為0.567 mg/L，最高值為2.811 mg/ L；麩皮中平均值為0.409 mg/ L，最高值為3.274 mg/L。2012-2014年間，華中地區的食品與食品添加劑的檢測結果顯示，90.2%的樣品中含有ZEN毒素[6]。這說明我國食品及飼料中ZEN污染現狀不容樂觀。

ZEN性質穩定，在儲藏、加工和高溫烹調條件下均不發生降解，通過食物進入體內，危害人和動物的健康[7]。ZEN對人畜的毒性主要是造成動物體內生殖激素分泌紊亂，破壞動物生殖發育系統[8]。動物中最為敏感的是豬，可使其出現假發情、不孕、假孕、流產死胎等癥狀[9]。ZEN還可以誘導動物免疫細胞毒性，降低動物的免疫能力，引起基因突變和細胞核病變；引發肝腎組織退行性變化，造成肝腎功能紊亂；激活內源性逆轉錄病毒和促進相關腫瘤抗原的表達，從而誘發腫瘤的發生[10]。

鑒于ZEN污染的普遍性和危害性，對其脫毒控制一直受到科研人員的關注。常用的物理和化學脫毒法因其在除毒的同時，也會被吸附或者改變谷物中營養成分。因此，目前脫毒的最佳方法是生物去毒[11]。在ZEN 微生物降解方面，早期分離到的主要是真菌，如el-Sharkawy等[12-15]發表了多篇關于真菌轉化ZEN的文章。Takahashi等[4]篩選到一株粉紅色螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)IF7063，可將ZEN轉化為無雌激素活性的代謝產物。采用細菌脫毒的研究較晚，據報道PseudomonasputiaZEA-1能夠降解100～200 mg/L ZEN[16]。程波財等[17]分離到一株藤黃微球菌，該菌在LB培養基中培養120 h后能夠降解2 mg/ L的ZEN。Tinyiro等[18]分離到能吸附和降解ZEN的兩株芽孢桿菌。盡管報道了不少能降解ZEN的微生物，但是真正能夠應用的很有限。因此，需要繼續篩選ZEN降解菌，擴大菌種資源庫，并應用于實際生產，這對于控制谷物中的ZEN毒素污染，保障人畜健康具有重要應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和培養基

樣品：2015年江蘇省不同小麥產區采集的小麥樣品。

培養基：基礎鹽培養基(MM)：K2HPO4(2.5 g/L)、KH2PO4(1.2 g/L)、 NH4NO3(1.0 g/L)、MgSO4.7H2O(0.2 g/L)、Ca(NO3)2.4H2O (0.4 g/L)、NaCl (0.5 g/L)和Fe2(SO4)3(0.001 g/L) (pH 7.0)，用于毒素降解菌的馴化富集；LB培養基：酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，培養基121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑

試劑：乙腈、甲醇為色譜純級，美國ROE公司；玉米赤霉烯酮標準品SIGMA公司；酵母粉、胰蛋白胨為食品級：上海生工生物有限公司; KH2PO4、K2HPO4、NH4NO3、MgSO4.7H2O、Ca(NO3)2.4H2O、Fe2(SO4)3、NaCl均為分析純：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米赤霉烯酮的提取檢測方法

玉米赤霉烯酮的提?。悍Q取5 g玉米粉(精確到0.01 g)置于150 mL離心管中，加入25 mL提取液(84%乙腈)，180 r/min振蕩提取30 min，8 000 r/min 離心5 min后取上清，取3 mL上清液潤洗氨基柱，取3 mL上清液過凈化柱，流速1 d/s，取3 mL 上清液淋洗2次，流速2 d/ s，收集濾液，氮氣吹干后，用50%甲醇重溶，過0.22 μm的濾膜后，上液質聯用儀檢測。

液相色譜檢測法：在文獻[19, 20]基礎上作部分改進，具體條件為：安捷倫Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，粒徑 5 μm)；進樣量：20 μL；流動相：乙腈∶水(80∶20v/v)；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器，檢測波長：236 nm。

液質聯用檢測：在文獻[21, 22]基礎上作部分改進，條件為：AB3500 LC/MS，四極桿質譜系統。液相色譜條件：進樣量：5 μL；流動相A：5 mmol/L醋酸銨水，B：色譜甲醇，梯度洗脫(見表1)；質譜參數：電噴霧電離模式(ESI-)，多反應監測模式(MRM)，離子源溫度：600 ℃，霧化氣：50 psi，輔助氣：50 psi，氣簾氣：35 psi，噴霧電壓：4500 V，碰撞室射出電壓：6 V，ZEN檢測的多反應監測質譜參數見表2。

ZEN降解率=(對照組ZEN含量-樣品組ZEN含量) ÷對照組含量×100%。

表1 流動相流速及梯度

表2 ZEN檢測的多反應監測質譜參數

1.2.2 ZEN降解菌的分離及純化

稱取5 g麥粒，用75%的乙醇浸泡3 min后，用無菌水洗滌3次，然后加入用無菌水清洗后的粉碎儀中，粉碎后，加入50 mL無菌水，放置于30 ℃，180 r/min 的搖床中，振蕩1 h后，10 000 r/min離心5 min后取上清，以10%的接種量加入到ZEN質量濃度為10 mg/L的MM培養基中，于30 ℃，180 r/min的搖床中連續培養7 d，以相同的方法轉接5次，用高效液相色譜法檢測培養液中ZEN含量。把具有ZEN降解效果的富集液涂布于LB平板上，30 ℃培養72 h后，選取不同的單菌落進行劃線純化后。再將純化后的單菌落接種于ZEN質量濃度為10 mg/L的MM培養基中，以不加菌、含有相同ZEN質量濃度的MM培養基為空白對照，30 ℃，180 r/min的搖床中連續培養72 h 后，用高效液相色譜檢測ZEN含量。選取降解ZEN效果明顯的菌株，再用液質聯用的方法進一步驗證，最終獲得ZEN高效降解菌株。

1.2.3 降解菌的菌種鑒定

形態鑒定：把降解菌接種到LB液體培養基中，30 ℃培養48 h后，用蔡司掃描電子顯微鏡(EVO-LS10)觀察菌體的形態；生理生化鑒定[23,24]：由中國普通微生物菌種保藏管理中心進行鑒定；細菌16S rDNA 基因序列測定：①基因組DNA的提?。翰捎酶啕}法[20]提取降解菌的基因組DNA；②16S rRNA序列的PCR反應引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3’；③gyrA基因引物：gyrA-F: CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT，gyrA-R:CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT；④測序：由上海生工生物工程技術有限公司純化和測序；⑤序列數據處理：測序結果在NCBI使用Blast比對，從GenBank數據庫中獲得與菌株16S rDNA 源和gyrA源的公認標準序列數據，使用MEGA5[25]，構建菌株的系統進化樹，最后綜合分析，確定降解菌的種屬地位。 1.2.4 環境因素對降解菌降解玉米赤霉烯酮的影響實驗

將降解菌7D3-2單菌落接種于LB液體培養基中，30 ℃、180 r/min培養至OD600為1.0左右，10 000 r/min 離心5 min，棄上清后，加入等體積的無菌水洗滌沉淀，10 000 r/min離心5 min后棄上清，再用和培養液等體積無菌水懸浮沉淀，制成種子液。1)培養溫度對菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響：將種子液按5%的接種量接入到含10 mg/LZEN的MM培養基中，分別于15、20、25、30、35、40 ℃，180 r/min搖床培養，同時以不接菌的含有相同ZEN質量濃度的MM培養基作為對照，每組設3次重復，48 h之后取樣，采用液質聯用的方法測定不同培養液中ZEN的含量。2)pH對菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響：將種子液按5%的接種量接入到含10 mg/L ZEN、pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0的MM培養基中，30 ℃、180 r/min搖床培養，同時以不接菌的含有相同ZEN質量濃度、pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0的MM培養基為對照，每組設3個重復，48 h之后取樣，采用液質聯用的方法測定不同培養液中ZEN的含量。3)接種量對菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響：將種子液分別按0.5%、1%、2%、5%、10%及20%體積比接入到含10 mg/L ZEN的MM培養基中，30 ℃、180 r/min搖床培養，同時以不接菌的含有相同ZEN質量濃度的MM培養基作對照，每組設3個重復，48 h之后取樣，采用液質聯用的方法測定不同培養液中ZEN的含量。(4)ZEN初始質量濃度對菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響：將種子液按5%的接種量接入到含有ZEN初始質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/ L ZEN的MM培養基中，30 ℃，180 r/min 搖床培養，同時以不接菌的含有相同ZEN質量濃度的MM培養基作為對照，每組設3次重復，48 h后取樣，采用液質聯用的方法測定不同培養液中ZEN含量。

1.2.5 玉米赤霉烯酮降解物質的定域實驗

采用滲透沖擊法[26]，按照下列程序分步提?。合热∨囵B24 h后的7D3-2菌液100 mL 室溫離心(6 000 r/min，10 min)上清液(S1)凍存；沉淀(P1)用10 mL(pH8.0)0.01 mol/ LTris-HCl重懸，離心(4 ℃，6 000 r/min，10 min)，洗滌2次，上清液(S2)凍存；沉淀(P2)以10 mL，25%蔗糖溶液重懸，于25 ℃震蕩10 min，離心(4 ℃，13 000 r/min，10 min)，上清液(S3)凍存；沉淀(P3)加冷的雙蒸水重懸，在冰水浴中震蕩10 min，離心(4 ℃，13 000 r/min，10 min)，上清液(S4)凍存；沉淀(P4)重懸于10 mL 0.01 mol/L Tris-HCl(pH7.5)中，在冰浴中超聲波破碎1 min，重復5次，間隔1 min，再離心(4 ℃，15 000 r/min，20 min)，上清液(S5)凍存，沉淀(P5)棄去，將S1、S2和S3合并，即為胞外提取液，S4為膜周質提取液，S5為膜內提取液。取三種提取液，加入到含有5 mg/L ZEN的MM培養基中，測定不同提取液對ZEN的降解能力，從而獲得ZEN降解物在細胞中的分布情況。

1.2.6 7D3-2對玉米粉中ZEN的降解實驗

稱取含有ZEN的玉米粉600 g，充分混合后平均分成12份，設對照和處理，空白：不做任何處理；對照1：加入200 mL無菌水；對照2：加入200 mL LB培養液；處理1：加入200 mL 7D3-2 LB培養液(OD600=2.0)。對照1、對照2、處理1置于30 ℃搖床中，180 r/min培養48 h后，40 ℃烘干，提取玉米粉中的ZEN，采用液質聯用的方法檢測樣品中ZEN含量，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 ZEN降解菌的初篩

以ZEN為選擇壓力，對采集到的樣品進行富集馴化培養，得到3組對ZEN具有降解功能的富集液，這3組富集液對ZEN的降解效果均達到90%以上，在LB平板上對這三組富集液進行涂布培養，對平板上生長出來的菌落進行ZEN降解功能的驗證，最終得到15株ZEN降解菌株。選擇降解能力最好的菌株7D3-2進行后續研究。

2.2 7D3-2對ZEN的降解

按5%的接種量把7D3-2的種子液接種到含有10 mg/L ZEN毒素的MM培養基中，30 ℃、180 r/min搖床中培養48 h后，取樣，加入色譜純乙腈，使乙腈的終體積分數為70%，超聲混勻后過孔徑0.22 μm的有機相針頭濾器，用高效液相色譜檢測培養液中的ZEN含量，檢測結果見圖1。結果表明，ZEN在7D3-2 的作用下，48 h后，基本檢測不到 ZEN，這表明7D3-2對ZEN毒素有很好的降解功能。

2.3 ZEN降解菌株7D3-2的鑒定

7D3-2在LB培養基上培養，其菌落呈乳白色，好氧，有芽孢，革蘭氏染色陽性，通過蔡司掃描電子顯微鏡EVO-LS10觀察，7D3-2菌體呈桿狀，大小約為0.5 μm×1.6 μm。

生理生化特征試驗表明：7D3-2能利用葡萄糖、明膠、蔗糖、檸檬酸等，不能利用糊精、D-麥芽糖、D-半乳糖、D-果糖等(表3)。

將7D3-2的16S rDNA基因序列和gyrA基因序列在NCBI進行Blast比對，從GenBank數據庫中獲得相關的標準序列數據進行系統發育分析，結果見圖2，7D3-2的16S rDNA基因序列與Bacillusamyloliquefaciens，Bacillussubtilis等的同源性高達99%，無法確定其屬種。因此，繼續對7D3-2的gyrA基因序列與芽孢桿菌屬的種進行比較，結合遺傳距離、最后綜合7D3-2的形態特征、生理生化特征以及遺傳發育地位，參照常見細菌系統鑒定手冊以及伯杰氏細菌鑒定手冊，7D3-2被初步確定為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillusamyloliquefaciens)[23,25]。

圖1 7D3-2對ZEN降解的液相色譜圖

表3 7D3-2的生理生化特性

項目結果項目結果項目結果項目結果接觸酶+硝酸鹽還原+葡萄糖利用+蔗糖利用+革蘭氏染色+酪素水解+D-果糖利用+糊精利用-芽孢+尿酶+D-甘露糖利用+松二糖利用-硝酸鹽還原+精氨酸雙水解+D-麥芽糖利用-果膠利用-氧化酶+明膠液化+慶大霉素抗性-吐溫利用-接觸酶+W檸檬酸利用-D-半乳糖利用-丙酸利用-

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“+W”表示弱陽性。

圖2 基于7D3-2 16SrDNA、gyrA基因序列的系統進化發育樹

2.4 環境因素對7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響

2.4.1 培養溫度的影響

培養溫度對菌株7D3-2降解ZEN的影響如圖3所示，在15～35 ℃溫度范圍內，7D3-2對ZEN的降解率呈現先升高后降低的趨勢，最適溫度是30 ℃，此溫度下ZEN的降解率高達96.82%，其次是35 ℃和25 ℃。說明在25～35 ℃范圍內，菌株7D3-2產生的降解物質活性較高。

圖3 培養溫度對菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響

2.4.2 初始pH的影響

起始pH對菌株7D3-2降解ZEN的影響如圖4所示，在pH在4.0～9.0的范圍內，7D3-2對ZEN的降解率呈現先增高后降低的趨勢，在pH7.0時，ZEN的降解率最高，達95.12%，其次是pH8.0、pH6.0。這說明當pH為6.0～8.0范圍時，7D3-2產生的降解物活性較高，過酸和過堿的條件下，ZEN降解活性大幅度降低。

圖4 初始pH對菌株7D3-2的降解玉米赤霉烯酮的影響

2.4.3 接種量的影響

接種量對菌株7D3-2降解ZEN的影響如圖5所示。由圖5可以看出，在接種量在0.5%～10%的范圍內，ZEN的降解率呈現升高的趨勢，ZEN的降解率最高可達 96.22%，當接種量大于10%時，ZEN降解率趨于平穩，不再增加。因此從經濟節約的角度出發，7D3-2降解ZEN的最適接種量為10%。

圖5 接種量對菌株7D3-2的降解玉米赤霉烯酮的影響

2.4.4 ZEN初始質量濃度的影響

ZEN質量濃度對7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影響如圖6所示。從結果可以看出， ZEN初始質量濃度為1.0～100.0 mg/L范圍內，ZEN降解率先處于平穩不變然后再逐漸降低的趨勢：當ZEN質量濃度為1.0～25.0 mg/L之間時， ZEN的降解率基本不變，都大于95%，當ZEN質量濃度大于25.0 mg/L時，降解率顯著降低；但是如果從ZEN的絕對降解量來看，ZEN初始質量濃度為1.0 ～100.0 mg/L范圍內，ZEN的絕對降解量隨著ZEN初始質量濃度的增加而增加，兩者呈正相關。

圖6 ZEN初始質量濃度對7D3-2降解ZEN的影響

2.5 玉米赤霉烯酮降解物質定域實驗結果

分別測定了不同部位的降解物質對ZEN的降解效率，結果見圖7。從結果可以看出，在菌株7D3-2中，ZEN降解物質主要位于胞外提取液中，胞內提取物和周質空間中的物質幾乎沒有ZEN降解活性，因此7D3-2中ZEN降解物質是分泌到細胞外的。

圖7 ZEN降解物質的定域實驗

2.6 7D3-2對玉米粉中ZEN的降解效果

含有ZEN的玉米粉經過處理后，放入30 ℃培養48 h后，提取各處理樣品中ZEN，并用液質聯用的方法檢測提取液中ZEN的含量，結果見圖8。從結果可以看出，和空白樣品相比，對照樣品1和2中ZEN質量濃度降低達到了極顯著水平，降解率為11.83%和17.82%；加入降解菌7D3-2處理的樣品中ZEN含量顯著低于對照1和對照2，降解率可以達到75.96%，因此7D3-2對玉米粉中ZEN具有很好的降解效果。

圖8 7D3-2對玉米粉中ZEN的降解

3 結論

3.1 采用富集培養的方法從麥粒中篩選到一株ZEN降解菌7D3-2。該菌株對ZEN的降解能力達95%以上；通過形態、生理生化特性以及16S rDNA、gyrA基因系統進化發育地位分析，7D3-2被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。3.2 7D3-2對ZEN有良好的降解效果，在含10 mg/L ZEN的MM培養基中，48 h對ZEN的降解率可達到95%以上；7D3-2降解ZEN的最適溫度為30 ℃，最適pH為7.0；當接種量小于10%時，ZEN的降解率與7D3-2接種量成正比；在ZEN初始質量濃度為1.0～25.0 mg/L時，ZEN降解率差異不顯著，但當ZEN質量濃度大于25.0 mg/L時，ZEN降解率與其初始質量濃度呈反相關，但是ZEN被降解的絕對量與初始質量濃度呈正相關。

3.3 降解物的定域實驗表明：7D3-2中降解ZEN的物質位于胞外上清液中；7D3-2不僅對培養液中ZEN具有降解效果，對玉米粉中的ZEN也有很好的降解效果。