程序性死亡受體1和程序性死亡受體配體1在食管鱗癌組織中的表達及意義

李紅敏，楊海軍，代寧濤，周福有

(1.河南科技大學臨床醫學院，河南 洛陽 471003；2.安陽市腫瘤醫院，河南 安陽 455000)

食管鱗癌是影響我國人民身體健康的重要惡性腫瘤之一，流行病學調查顯示，食管鱗癌發病率位于我國常見腫瘤第6位，死亡率位于第4位，男性發病率高于女性，農村高于城市[1]。我國食管鱗癌發病呈明顯地域趨勢，高發區發病率顯著高于周邊地區，在太行山沿線地區，特別是在豫北地區的林州市(林縣)及其毗鄰地區，食管鱗癌和賁門癌發病率占當地所有腫瘤發病率的81%,發病率顯著高于相應省份。食管鱗癌早期臨床癥狀不明顯，發病隱匿，就診時多已是中晚期，預后差，5 a生存率低。

程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)又名CD279，屬于超蛋白CD28家族成員之一，共有268個氨基酸組成，表達于T淋巴細胞的膜表面，與程序性死亡受體配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)結合可以抑制T淋巴細胞活化，介導腫瘤免疫逃逸。在胃癌、非小細胞肺癌、大腸癌和黑色素瘤等多種腫瘤的發生過程中均可以檢測到PD-1、PD-L1的高表達[2-5]，并提示預后較差。但在小細胞肺癌中高表達PD-1、PD-L1提示預后較好[6]。本研究通過檢測食管鱗癌組織中PD-1、PD-L1的表達情況，以期了解該通路與食管鱗癌發生的關系。為尋找食管鱗癌新的治療方法和方向提供一定理論依據。

1　材料與方法

1.1一般資料選取安陽市腫瘤醫院2016年7月至2017年6月間胃鏡活檢結果為正常的患者50例；食管不典型增生49例；術前未進行放、化療及免疫治療，未合并其他腫瘤和消化道疾病，術后病理確診為食管鱗癌患者49例。所有入組對象均簽署患者科研知情同意書，提交安陽市腫瘤醫院倫理委員會倫理審查，審查通過后正式入組。其中食管不典型增生患者中，男30例，年齡51～77(59±5.5)歲；女19例，年齡49～76(61±5.5)歲。食管鱗癌患者中，男28例，年齡51～79(60±5.5)歲；女21例，49～77(62±5.5)歲。

1.2免疫組化染色采用免疫組化S-P法檢測不同食管組織中PD-1和PD-L1，PD-1羊抗人單克隆抗體按照說明書150稀釋離心(稀釋液為蒸餾水)。PD-L1羊抗人單克隆抗體按照預實驗結果1300稀釋離心(稀釋液為自制蒸餾水)，二抗即用型，均購自北京中杉金橋生物工程有限公司。組織蠟塊經3 μm連續切片，烤片后脫蠟、水化；檸檬酸修復液加熱2 min抗原修復；逐步滴加阻斷液過氧化物酶(避光10 min)，正常非免疫動物血清封閉(室溫孵育10 min)，一抗(4 ℃ 過夜)，二抗(37 ℃孵育30 min)，鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶溶液(室溫10 min)，DAB顯色。鏡下控制顯色程度，水洗、復染、返藍，脫水后中性樹膠封片，鏡檢。

1.3結果判定PD-1、PD-L1陽性結果判定參考Bukholm等[7]制定的標準，由2位本院病理學專家采用雙盲法觀察切片，半定量法計算結果，每例隨機觀察5個高倍視野(×400)，共計數200個需觀察目標細胞，計數總數及陽性細胞數：陽性細胞數≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強度:無色為0分，黃色為1分，黃褐色為2分，深褐色為3分。將2項積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)，其中后三者均記為陽性。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行統計學分析，計數資料以百分數表示，組間比較用χ2檢驗，兩變量之間的相關性采用Spearman分析，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1不同食管組織中PD-1、PD-L1表達的比較PD-1表達于浸潤性淋巴細胞和腫瘤細胞的細胞膜上，部分細胞質中可見，PD-L1主要表達于腫瘤細胞和部分間質細胞的細胞質中(圖1、2)。食管鱗癌組織中PD-1蛋白陽性率高于正常食管黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.05)；食管鱗癌組織中PD-L1蛋白陽性率高于食管不典型增生和正常食管黏膜組織，差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)。

圖1　正常食管黏膜(A)、食管不典型增生(B)和食管鱗癌(C)組織中PD-1的表達(S-P，×400)

圖2　正常食管黏膜(A)、食管不典型增生(B)和食管鱗癌(C)組織中PD-L1的表達(S-P，×400)

組織類型nPD-1陽性率/%PD-L1陽性率/%正常食管黏膜5018.020.0食管不典型增生4922.422.4食管鱗癌4936.749.0

2.2PD-1、PD-L1在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理特征的關系PD-L1的表達與食管鱗癌患者腫瘤浸潤層次及TNM分期有關(P<0.05)。見表2。

表2　PD-1、PD-L1在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理特征的關系　n(%)

2.3食管鱗癌組織中PD-1、PD-L1表達的相關性PD-1和PD-L1在食管鱗癌組織中的表達無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表3　食管鱗癌組織中PD-1和PD-L1表達的相關性　n

3　討論

T淋巴細胞可以通過白介素家族成員等誘導PD-1激活，激活的PD-1與其配體PD-L1結合后抑制腫瘤免疫微環境，并負調控T淋巴細胞的活性和增殖能力，從而降低T淋巴細胞介導的免疫殺傷，導致腫瘤細胞免疫逃逸。這是因為PD-1是T淋巴細胞上的共抑制因子之一，與其配體PD-L1結合后細胞質區免疫受體酪氨酸轉換基序結構域上的酪氨酸發生磷酸化，并通過遏制抗細胞凋亡因子Bcl-XL的表達下調白介素-2和葡萄糖代謝，誘導T淋巴細胞功能失活，負調控細胞免疫功能。因此PD-1、PD-L1的過表達可以使多種腫瘤預后變差。PD-L1是PD-1的配體之一，由PD-L1基因編碼，位于9號染色體p24.1上。PD-1、PD-1通路在正常生理情況下可以維持人體自身的免疫耐受，防止過度炎癥反應和自身免疫性疾病的發生，但是在病理情況下，PD-1、PD-L1在腫瘤免疫逃逸方面起到了重要作用。

我們在研究中發現，PD-1蛋白表達于T淋巴細胞和部分上皮細胞的細胞膜上，正常食管黏膜和食管不典型增生組織中的表達水平差異不明顯。在食管鱗癌組織中PD-1陽性率要顯著高于正常食管黏膜，但與食管不典型增生組織無明顯差異。PD-1在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理特征也無明顯相關性。Kim等[8]研究認為PD-1的表達和食管鱗癌臨床病理特征和預后無明顯相關性，這與本研究結果一致，因此我們考慮PD-1在食管癌進展期作用可能更加明顯。但Feng等[9]認為PD-1在食管不典型增生組和正常食管組中陽性率差異也較明顯，癌變組顯著高于正常食管組和食管不典型增生組，這與本研究結果并不一致。PD-L1表達在腫瘤細胞和部分間質細胞的細胞質中，少數腺體細胞的細胞質中也有表達，正常食管組和食管不典型增生組比較陽性率無顯著差異。PD-L1在食管鱗癌組織中表達要明顯高于正常食管組和食管不典型增生組。本研究證實PD-L1與食管鱗癌浸潤層次和TNM分期有顯著相關性(P<0.05)這與課題組前期實驗結果相似，也與Chen等[10]的研究結果一致。提示PD-L1表達失衡可能是導致食管癌發生的因素之一。

本研究認為PD-L1可能是介導食管鱗癌發生、發展的一個重要因素。因此阻斷PD-1/PD-L1通路，恢復T淋巴細胞免疫監視功能，將會是食管鱗癌免疫治療的新靶點，并會為食管鱗癌治療提供新的方向。