草分枝桿菌胞壁肽聚糖的分離提取和鑒定

王小柱

（遼寧省畜產品安全監察所，遼寧 沈陽 110003）

草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，M.phlei）是一種從牧草中最先分離純化出來的耐酸桿菌，在土壤、植物和飲水中廣泛分布。滅活后的草分枝桿菌對人畜無致病性，具有抗菌、調節腸道微生物平衡、提高免疫力、提高食物消化利用率等功能[1]。分枝桿菌細胞壁由肽聚糖（PG）、脂多糖（LPS）、磷壁酸（TA）、類脂A相關蛋白（LAP）、表面相關物質（SAM）等多種活性成分構成。肽聚糖是革蘭陽性菌等原核生物細胞壁特有的組分，可作為真核免疫系統識別的理想靶位[2-3]。目前，肽聚糖提取分離均采用Sekine建立的雙歧桿菌完整肽聚糖提取法。但該法試驗步驟繁瑣，整個過程需要15 d左右，耗時長，得率低。宋曉玲等在試驗基礎上進一步改進了孟凡倫的方法，只用1周時間即可制得雙歧桿菌的粗提肽聚糖產品[4-5]。此法既節約時間又簡便易行。本試驗在此方法上對超聲破碎輔助提取草分枝桿菌肽聚糖進行了初步研究，為草分枝桿菌在工業、農業、醫藥和食品領域的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑材料：以實驗室冷藏斜面保存草分枝桿菌為試驗材料。

試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、ddH2O、胰蛋白酶、Tris-Hcl（pH=7.5）、乙酸鈉、氯仿、甲醇、葡萄糖標準溶液、溶菌酶。

1.2 設備與儀器GL21M高速冷凍離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；HZQ-F170震蕩培養箱，哈爾濱市東聯生化儀器；UV-2500紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；SCIENTZ-650E超聲波細胞粉碎機，浙江新芝生物科技股份有限公司；1260型液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草分枝桿菌的培養

1.3.1.1 菌種活化首先用60℃水浴加熱冷藏的裝有已純化的草分枝桿菌管，10 min后取出，在固體瓊脂培養基板中劃線接種，37℃條件下培養24 h，槍頭挑取單克隆菌落，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨培養基中，振蕩培養12 h。

1.3.1.2 生長曲線的測定取培養好的草分枝桿菌，以2%接種量轉接液體培養基，37℃、220 r/min培養24 h，定時測定OD600值，并進行細胞計數。

1.3.1.3 擴大培養及菌體收集取單菌落接種于50 mL培養基中，37℃恒溫水浴振蕩箱中振蕩培養，200 r/min，24 h，1%接種于100 mL液體培養基中，180 r/min，37℃振蕩培養18 h。離心沉淀收集菌泥，用0.9%生理鹽水反復洗滌菌泥至乳白色，計算該菌體濕重。

1.3.2 草分枝桿菌肽聚糖的提取

1.3.2.1 去磷壁酸將上述細菌沉淀用80 w功率，累計超聲20 min（超聲3 s，間隔2 s）。隨后將超聲處理的細胞壁沉淀懸浮在10%三氯乙酸中，37℃條件下水浴15 min，冷卻至室溫。用4 000 r/min，離心18 min收集沉淀，用蒸餾水洗滌3次。

1.3.2.2 去脂質將獲得沉淀懸浮于乙酸鈉-氯仿-甲醇的混合液中，體積比為4:5:10。靜止40 min，4 000 r/min離心30 min收集沉淀。

1.3.2.3 去蛋白將上步得到的沉淀加入到含有1 mg/mL胰蛋白酶，0.1 mol/L，pH=7.5的Tris-Hcl緩沖溶液中，37℃水浴12 h，8 000 r/min離心15 min棄去沉淀，冷凍干燥得白色粉末即為肽聚糖。

1.4 生化特性研究

1.4.1 溶菌酶溶解試驗參照金盼盼的方法[6]，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.2）將提取肽聚糖配成1 mg/mL溶液，加溶菌酶250 μg/mL，在37℃，140 r/min振蕩處理22 h，測定OD600。

1.4.2 蛋白質含量的測定以考馬斯亮藍G250為染液，標準參考蛋白BSA，Bradford法測定粗提肽聚糖物的蛋白含量（%）。

1.4.3 總脂肪含量的測定分別量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL膽固醇標準溶液于試管中，同時加入肽聚糖樣品1 mg于另外3支試管中，無水乙醇混至1 mL搖勻。然后分別量取0.2 mL，對應加入濃硫酸1 mL，沸水浴20 min充分水解脂類，冷卻。隨后加入香草醛3 mL，室溫靜置20 min，測定OD525。繪制標準曲線。

1.4.4 總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法。取10支試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖標準溶液，另取3支試管分別加入1 mg肽聚糖樣品，蒸餾水定量至1 mL；再加入1.0 mL 5%的重蒸苯酚溶液和濃硫酸5 mL，立即搖勻。沸水浴25 min，取出后快速冷卻至室溫。分別測定各管OD490，以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標，以吸光度OD490為縱坐標繪制標準曲線，測定總糖含量。

1.5 化學結構的分析

1.5.1 紅外光譜分析用溴化鉀（KBr）將肽聚糖提取物壓片，在4 000～370 cm-1范圍內用傅里葉變換紅外光譜分析儀掃描分析。

1.5.2 SDS-PAGE分析肽聚糖分子量用pH=6.2的PBS將肽聚糖提取物配成1 mg/mL，加入200 μg/mL的溶菌酶，37℃消化12 h。然后從中取1 mL樣品，3 000 r/min離心除去蛋白質，取上清。用5%濃縮膠，12%分離膠進行電泳。

2 結果與分析

2.1 生長曲線測定結果由草分枝桿菌生長曲線可知，在0～5 h內處于初始期，在5～15 h內處于對數期，在16～20 h時處于平緩期。在18 h草分枝桿菌達到對數生長期末期，其生長量最大，OD值為1.843，活菌數為7.3×108/mL。

2.2 PG得率計算草分枝桿菌由10.78 g（細胞干重）獲得粗制肽聚糖1.43 g，獲得率13.33%。

肽聚糖得率（%）=得到的肽聚糖質量/處理的菌體質量×100%=1.43 g/10.78 g×100%=13.33%

2.3 組成成分及化學結構的分析

圖1 草分枝桿菌生長曲線Fig.1 Standard curve ofM.phlei.

2.3.1 溶菌酶溶解測定

表1 PG溶菌酶消化試驗Table 1 PG lysozyme digestion experiment

在草分枝桿菌肽聚糖被溶菌酶消化的過程（16 h）中，其吸光度值變化見表1。在8 h內，隨水解時間延長，溶液吸光值逐步降低。9 h后吸光值趨于平緩，說明該提取物可被溶菌酶消化降解，為肽聚糖。

2.3.2 蛋白質含量測定 100 μg/mL BSA標準溶液曲線如圖2。其回歸方程為y=61.382x+0.0081，決定系數R2=0.9996（其中x軸為標準蛋白液的濃度，y軸為595 nm處吸光度值），表明檢測蛋白質含量具有較好的線性相關性。3次測量取均值得出肽聚糖樣品的平均吸光值是0.255。計算得知，該樣品蛋白質含量為4.02 μg/mL，約占肽聚糖樣品的4.02%。

圖2 牛血清蛋白（BSA）溶液標準曲線Fig.2 Standard curve of BSA

2.3.3 總脂含量的測定 0.1 mg/mL膽固醇母液標準溶液曲線如圖3。其回歸方程為y=0.9967x-0.0207，決定系數R2=0.9961（其中x軸為標準膽固醇母液的體積，y軸為525 nm處的吸光值），表明檢測脂肪含量具有良好的線性相關性。3次測量取均值得出肽聚糖樣品的平均吸光值是0.0198由回歸方程得，脂肪含量為0.041 mg/mL，由此得出總脂含量為4.1%。

圖3 膽固醇溶液標準曲線Fig.3 Standard curve of cholesterol

2.3.4 總糖含量的測定 100 μg/mL葡萄糖標準溶液曲線，如圖4。其回歸方程為y=0.097x-0.2636，決定系數R2=0.9973（其中x軸為葡萄糖含量，y軸為490 nm處的吸光值），表明檢測葡萄糖含量具有良好的線性相關性。3次測量取均值得出肽聚糖樣品的平均吸光值是0.6375由回歸方程得，總糖含量為38.54 μg/mL，由此得出總糖含量為38.54%。

圖4 葡萄糖溶液標準曲線Fig.4Standard curve of glucose

2.4 肽聚糖化學結構分析

2.4.1 紅外光譜分析肽聚糖提取物紅外光譜圖如圖5所示。-OH鍵通常在3 500～3 100 cm-1處有振動伸縮；C-H鍵通常在3 000～2 800 cm-1處振動伸縮；糖類物質在1 400～1 200 cm-1處也出現峰群振動伸縮；N-H鍵變角振動出現在1 560～1 520 cm-1處；C-O-H鍵伸縮振動出現在1 200～1 000 cm-1范圍。在判斷糖苷鍵的類型上，α構型吸收峰出現在840 cm-1附近，β型出現在880 cm-1附近[7-8]。根據圖5，本試驗中從草分枝桿菌細胞壁中提取出的糖為β型肽聚糖。

圖5 肽聚糖提取紅外光譜分析Fig.5 FITR analysis of peptidogly

2.4.2 SDS-PAGE分析結果電泳結果如圖6。1為樣品，2為空白。在肽聚糖的電泳試驗中，由于其溶解度極低，需先經溶菌酶消化降低肽聚糖分子量，然后對可溶性肽聚糖進行電泳。經染色后為單一條帶，大小在55～70 ku之間，由此說明本試驗分離的肽聚糖分子量約為62 ku。

圖6 肽聚糖提取物SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of peptidoglycan

3 討論

從草分枝桿菌中分離提取細胞壁的過程中，首先采用了超聲波方法破碎細胞壁，條件為功率80 w，超聲時間40 min，處理溫度為25℃。隨后結合三氯乙酸法從破碎的細胞壁中提取肽聚糖，大大提升了肽聚糖的得率，與樂軍等的提取結果大致相同[9-12]。本試驗中肽聚糖分離提取得率為13.33%。在提取的肽聚糖中，總糖占38.54%，蛋白質占4.02%，總脂含量占4.1%。肽聚糖是N-乙酰胞壁酸二糖單元和β-（1，4）-糖苷鍵連接的N-乙酰葡糖胺以及肽橋與四肽亞單位組成的聚合物。通過對提純的肽聚糖提取物的化學成分分析和紅外光譜及高效液相色譜結構質鑒定，確定提取物主要成分為肽聚糖。由于肽聚糖不易溶于水，最終采用了先用溶菌酶消化降低其分子量，然后進行SDS-PAGE電泳試驗，確定出本試驗提取肽聚糖分子量約為62 ku。