環糊精水提法提取積雪草中的三萜類化合物

常 春，趙亞南，曾愛國

(1.西安交通大學藥學院，西安 710061；2.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，西安 710065)

積雪草為傘形科植物Centellaasiatica(L.)Urb.的干燥全草，性苦、寒，味辛，歸肝、脾、腎經，具有清熱利濕、解毒消腫的功效，臨床上用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒和跌撲損傷[1]?，F代藥理研究發現，積雪草具有抗抑郁[2]、抗腫瘤[3]、修復皮膚系統[4]、抗胃潰瘍[5]和保護心血管系統[6]等作用。積雪草的化學成分主要有三萜類、多炔烯烴類、黃酮類和揮發油類，還含有綠原酸、內消旋肌醇、黃酮醇、脂肪酸、天胡姜堿、葉綠素、烴類、木脂素類、糖、鞣質和多元酚類等成分[7-8]。三萜類化合物是積雪草發揮藥理作用的主要活性成分，主要包括積雪草苷、羥基積雪草苷、積雪草苷-B、積雪草酸和羥基積雪草酸5種化合物[8-9]。目前，積雪草三萜類化合物主要采用乙醇提取，但會污染環境、成本較高，且具有一定的危險性[10-11]。

環糊精(cyclodextrin，CD)作為一種環狀低聚糖，具有內疏水、外親水的空腔，可與多數化合物結合成主客體包合物，從而增加化合物的溶解度和生物利用度[12-13]。近年來，采用環糊精提取中藥活性成分的研究逐漸增多，取得了較理想的結果[14-15]。與有機溶劑提取相比，環糊精提取法以水為溶劑，具有安全、經濟和環保的特點。本文以環糊精水溶液作為提取溶劑，采取回流法提取積雪草中三萜類化合物，并研究環糊精種類、環糊精濃度、料液比、藥材粒度及提取時間對提取的影響。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀，包括LC-20A泵、SPD-20A檢測器和LC solution色譜工作站，AUY220型電子天平(日本島津公司)；AT-330型柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；KQ3200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-3型循環水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；DF-101S型恒溫水浴鍋(河南省予華儀器有限公司)。

1.2試藥 羥基積雪草苷(質量分數>99%)，積雪草苷(質量分數>99%)，積雪草苷-B(質量分數>99%)，積雪草酸(質量分數>95%)和羥基積雪草酸(質量分數>98%)，均購自西安開來生物工程有限公司；α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD，均購自南京森貝伽生物技術有限公司；甲醇、乙腈(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；三蒸水(自制)；積雪草藥材，購自西安市南郊藥材市場，經西安交通大學藥學院郭增軍教授鑒定為傘形科植物積雪草Centellaasiatica(L.)Urb.的干燥全草。

2 方法

2.1環糊精水提法 精密稱取積雪草粉末2 g，置于圓底燒瓶中，再加入適量環糊精水溶液，加熱回流提取。

2.2索氏提取法 精密稱取積雪草粉末(過6號篩)2 g，加適量石油醚，索氏提取6 h，棄去石油醚；再加入適量乙醇提取5 h，至溶液顏色不再加深，移至蒸發皿中，蒸干；加適量水制成混懸液，再加入水飽和的正丁醇萃取3次；正丁醇液蒸干，用適量甲醇溶解。

2.3含量測定方法

2.3.1對照溶液的配制 分別精密稱取積雪草苷對照品、積雪草苷-B對照品、羥基積雪草苷對照品、羥基積雪草酸對照品和積雪草酸對照品分別10，10，10，4和2 mg，置于同一20 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，將上述混合對照溶液逐級稀釋，得到積雪草苷、積雪草苷-B、羥基積雪草苷、羥基積雪草酸和積雪草酸質量濃度分別為5～500，5～500，5～500，2～200和1～100 μg·mL-1的系列溶液。

2.3.2樣品溶液的配制 取2.1或2.2項下方法制備的提取液過濾，取續濾液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣分析。

2.3.3色譜條件 色譜柱：TIANHE Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水溶液(含2 mL·L-1磷酸)(25∶75)；柱溫：30 ℃；檢測波長：205 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL?；旌蠈φ掌放c積雪草樣品色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

a.積雪草樣品；b.混合對照品；1.積雪草苷；2.積雪草苷-B；3.羥基積雪草苷；4.羥基積雪草酸；5.積雪草酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

a.Centellaasiaticasample；b.mixed standard solution；1.asiaticoside；2.asiaticoside B；3.madecassoside；4.madecassic acid；5.asiatic acid.

3 結果

3.1環糊精種類 稱取適量α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD，分別用三蒸水溶解，制得含α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD濃度均為20 mmol·L-1的環糊精水溶液。稱取積雪草粉末(過3號篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10(g·mL-1)加入環糊精水溶液，加熱回流提取1 h。比較α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD對積雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖2。

圖2不同環糊精對積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.2 Effects of different cyclodextrins on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖2可知，當采用α-CD、β-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD提取時，羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率極低；而采用γ-CD提取時，羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率較高。采用β-CD、HP-β-CD、γ-CD和Glu-β-CD提取時，積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷的提取率較高，且相差較??；而采用α-CD提取時，積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷的提取率較低。相對于α-CD、β-CD、Glu-β-CD和HP-β-CD 4種環糊精，γ-CD對積雪草中5種三萜類化合物的提取率均較高，因此選擇γ-CD提取積雪草三萜類化合物。

3.2γ-CD的濃度 稱取適量γ-CD，配制成濃度分別為10，15，20，25和30 mmol·L-1的γ-CD水溶液。稱取積雪草粉末(過3號篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10(g·mL-1)加入環糊精水溶液，加熱回流提取1 h?？疾歃?CD濃度對積雪草三萜類化合物提取效率的影響，見圖3。

圖3γ-CD濃度對積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.3 Effects ofγ-CD concentration on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖3可知，積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷在10～30 mmol·L-1γ-CD水溶液中的提取率保持在穩定的水平；而羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率隨著γ-CD濃度的增加先增大后減小，在γ-CD濃度為15 mmol·L-1時最大。因此，選擇γ-CD的濃度為15 mmol·L-1。

3.3料液比 稱取積雪草粉末(過3號篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30(g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加熱回流提取1 h?？疾炝弦罕葘Ψe雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖4。

圖4料液比對積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖4可知，積雪草酸和羥基積雪草酸的提取率隨著料液比的增加而增加，羥基積雪草苷的提取率呈降低趨勢，積雪草苷和積雪草苷-B的提取率在料液比為1∶20～1∶30之間差別不大。在料液比為1∶20時，5種三萜類化合物的提取率均較高，因此料液比選擇1∶20(g·mL-1)。

3.4提取時間 稱取積雪草粉末(過3號篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶20 (g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加熱回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和5.0 h?？疾焯崛r間對積雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖5。

圖5提取時間對積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.5 Effects of extracting time on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖5可知，提取時間對積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷的提取率影響不明顯，但羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率隨提取時間的增加而減小。提取時間為1.0 h時，5種三萜類化合物的提取率均較高，因此提取時間選擇1.0 h。

3.5粒度 稱取一定粒度的積雪草粉末2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶20 (g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加熱回流提取1 h?？疾焖幉牧６葘Ψe雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖6。

圖6藥材粒度對積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.6 Effects of particle size on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖6可知，積雪草三萜類化合物的提取率隨著藥材粒度的減小而增加，因此本實驗選擇過6號篩的積雪草粉末。

3.6環糊精水提法與索氏提取法比較 分別采用優化的環糊精水提工藝和索氏提取法對積雪草進行提取，比較積雪草苷、積雪草苷-B、羥基積雪草苷、羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率。在索氏提取法中，積雪草苷、積雪草苷-B、羥基積雪草苷、羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率分別為3.76，1.44，1.71，2.60和2.47 mg·g-1；在環糊精水提法中，5種三萜類化合物的提取率分別為1.58，1.36，1.87，3.61和1.49 mg·g-1。由此可見，環糊精水提法中羥基積雪草苷和羥基積雪草酸的提取率高于索氏提取法，而積雪草苷、積雪草苷-B和積雪草酸的提取率低于索氏提取法。

4 結論與討論

以環糊精水溶液作為提取溶劑，采取回流法提取積雪草中的三萜類化合物，研究環糊精種類、環糊精濃度、料液比、藥材粒度及提取時間等因素對提取率的影響。結果表明，積雪草三萜類化合物的最佳提取條件為γ-CD 15 mmol·L-1，藥材粒度為過6號篩，料液比選擇1∶20(g·mL-1)，提取時間為1.0 h。

環糊精是經葡萄糖糖基轉移酶發酵后得到的由α-1，4-葡萄糖苷鍵連接若干個D-吡喃葡萄糖單元形成的環狀低聚物，其具內疏水、外親水的空腔，可與許多物質(客分子)結合成主客體包合物，在制劑開發、藥物分析、生物傳感器、合成人造酶、化妝品和食品科技等方面的應用越來越廣泛。環糊精與客分子形成主客體包合物時，客體分子的大小、形狀應與環糊精的內腔相匹配。積雪草三萜類成分主要是五環三萜骨架的化合物，分子體積和相對分子質量較大，與內腔較大的γ-CD匹配性較好。因此，相對于α-CD、β-CD、Glu-β-CD和HP-β-CD 4種環糊精，γ-CD對積雪草中5種三萜類化合物的提取率較高。此外，環糊精的內腔疏水，因此客分子的極性也影響主客體包合物的形成和穩定。一般情況下，客分子的極性越小，越易形成主客體包合物，主客體包合物越穩定。因此，環糊精水提法中，極性較小的羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率相對較高；而極性較大的積雪草苷和積雪草苷-B的提取率相對較小。

環糊精水提法可將積雪草三萜類化合物的提取和包合過程一步完成，簡化工藝，對開拓積雪草三萜類化合物在藥學方面的應用是有意義的嘗試；且本方法以水作為溶劑，具有安全、經濟和環保的優點。