3株耐鹽細菌對萘、菲、惹烯和苯并[α]芘的降解性能

陳弘昊，李作揚，陳泉睿，何潔，趙歡，王斌

(1.大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學 海洋科技與環境學院，遼寧 大連 116023)

多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)作為石油的主要成分，是最早發現的強致癌物[1]。由于其高疏水性和化學穩定性，極易在人體內富集，致癌、致畸和致突變[2-3]，目前人類生態環境受到了多環芳烴的嚴重污染，因此，PAHs被美國環保局列入了129種優先控制環境污染物的黑名單[4]。全世界每年大約有23萬t多環芳烴污染物進入海洋環境[5]。此外，大氣中的PAHs通過遷移、沉降等作用進入水體和土壤，水環境中的PAHs最終也將以沉積形式存在，而土壤中PAHs會通過擴散和滲透作用進入地下水或者被植物吸收進入食物鏈。因此，土壤是多環芳烴污染物存在的主要生態環境[6]。全球范圍內普遍存在土壤和海洋等區域多環芳烴污染的問題[7]，陸地和海洋中石油的開采、儲運和加工等過程中均可造成PAHs在土壤和海底的沉積，形成鹽漬化石油污染的土壤和沿海灘涂[8]，鹽漬化土壤這類高鹽環境的污染影響更加惡劣[9]，其修復難度更大。

近年來，國內許多相關研究人員致力于從高度污染區域中篩選出高效降解PAHs的菌株，并對其降解性能進行初步研究[10]。倪雪等[11]從受到PAHs污染的植物體內分離到兩株菲降解菌，鄧軍等[12]從PAHs污染較嚴重的土壤中分離到一株PAHs降解菌，田志剛等[13]也從勝利油田附近石油污染區篩選到一株PAHs降解菌。此外，也有關于耐鹽細菌對常溫和低溫高鹽土壤中PAHs降解情況的報道[14-17]，而有關海洋環境PAHs污染細菌降解的報道較少。鑒于目前石油泄漏、工業排放所造成的海水及沉積質PAHs污染的生物修復需求，本研究中選用分離自遼寧盤錦紅海灘地區翅堿蓬根系土壤及沿海灘涂土壤中分離出的高效降解石油菌株，處理高鹽水環境中的4種多環芳烴(萘、菲、惹烯、苯并[α]芘)，采用氣質聯用(GC-MS)技術測定處理前后目標化合物含量，同時研究試驗菌株在不同濃度的共代謝基質(葡萄糖)存在下對4種多環芳烴標志物的降解效率，以期為高鹽污水和海洋環境PAHs污染物的降解和生物修復篩選功能菌株，為今后實際應用提供借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌種為遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室從翅堿蓬根系及其土壤中篩選出的對柴油具有高降解性能的微桿菌Microbacteriumsp.(編號S1)、劉志恒菌Zhihengliuellasp.(編號G12)[18]，以及分離自遼寧盤錦沿海灘涂土壤的惡臭假單胞菌Pseudomonputida(編號Y3)[19]，菌種凍存管使用2216E液體培養基活化后使用。

試驗用培養基分別為2216E液體培養基及固體培養基、無機鹽基礎培養基、PAHs-無機鹽培養基。無機鹽基礎培養基包含NaCl(20 g/L)、NH4Cl(0.5 g/L)、KH2PO4(0.5 g/L)、K2HPO4(1 g/L)、KC1(0.01 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、CaC12(0.002 g/L)、FeSO4(0.01 g/L)、蒸餾水(pH 7.2)。PAHs-無機鹽培養基是用丙酮(分析純，生工)充分溶解萘、菲、惹烯和苯并[α]芘4種PAHs，再用微孔濾膜過濾除菌后添加進已滅菌的無機鹽培養基中，過夜使丙酮充分揮發后制成[20]。本研究中苯并[α]芘的濃度依照中華人民共和國國家海水水質標準[21]為基礎進行設置，其他3種目標PAHs以苯并[α]芘濃度為基準，終濃度均為20 mg/L。

1.2 方法

本研究中依照海水水質標準GB 3097-1997[21]為基礎，設置4種PAHs加標無機鹽培養基，預先通過氣質聯用儀測定并繪制出標準品的濃度標準曲線，對3株菌作用7 d后，培養基中殘留的PAHs進行測定。

1.2.1 色譜條件設置 采用氣相-質譜(GC-MS)分析對萘、菲、惹烯和苯并[α]芘4種PAHs的含量進行測定，參考國家石油化工行業標準(SH/T 0606—94)[22]及多環芳烴標準品說明書設置具體色譜條件，結果見表1。

表1 萘、菲、惹烯、苯并[α]芘色譜條件Tab.1 Chromatographic conditions of naphthalene,phenanthrene,retene, and benzo [α] pyrene

1.2.2 4種PAHs標準曲線的繪制 采用外標法對4種多環芳烴標準品進行定量檢測。以正己烷作為溶劑，分別準確配制濃度為2、20、200 mg/L的萘、菲、惹烯、苯并[α]芘標準液。按表1設置條件進樣測定。根據Agilent 7890B/5977A型GC—MS儀器對不同濃度的4種多環芳烴標準品測定結果，使用Agilent MassHunter定量分析軟件繪制標準曲線圖，使用最小二乘法進行線性擬合得到標準曲線(表2)，4種曲線的相關性系數R2均大于0.98，擬合度較好，可用于后續試驗中萘、菲、惹烯、苯并[α]芘含量測定。

1.2.3 3株菌在4種PAHs-無機鹽培養基中生長的測定 取3株菌的2216E液體培養物(1×109CFU/mL)0.1 mL，分別接種于50 mL PAHs-無機鹽液體培養基中，每組設置3個平行，以不接菌的培養基作為對照組，置于30 ℃下避光恒溫培養7 d后，用2216E平板測定其生長情況。同時分別配制葡萄糖濃度為0、0.5、1.0、1.5 g/L的4種PAHs-機鹽培養基，同法接入3株試驗菌并測定其生長情況。

表2萘、菲、惹烯、苯并[α]芘標準曲線及其相關系數

Tab.2Formulaofstandardcurvesandcorrelationcoefficientsofnaphthalene,phenanthrene,retene,benzo[α]pyrene

多環芳烴PAHs標準曲線standard curve相關系數R2萘 naphthaleney=0.0025x+4686.10.9990菲 phenanthreney=0.0012x-90360.9933惹烯 reteney=0.297x+3101.40.9997苯并[α]芘 benzo [α] pyreney=0.0715x-4614.90.9989

1.2.4 3株菌對4種多環芳烴降解性能的測定 將3株菌的2216E液體培養物(1×109CFU/mL)按1%的接種量，分別接種于含不同濃度葡萄糖(0、0.5、1.0、1.5 g/L)的PAHs-無機鹽培養基中，每組設置3個平行，以不接菌的培養基作為對照組，置于25 ℃恒溫振蕩培養箱中以160 r/min避光培養7 d。利用紫外分光光度法測定菌懸液的OD值，根據標準曲線換算出菌體數[18]，同時滴加5 mL二氯甲烷(色譜純)至培養液中，混勻后移入分液漏斗，再取5 mL二氯甲烷清洗管壁黏附的多環芳烴，清洗液移入分液漏斗中，充分震蕩后靜置直至分層，收集分液漏斗下方有機相，移入1.5 mL色譜瓶中作為萃取液密封備用。將上述所得萃取液上機檢測，分別進行定性、定量分析。其中降解率及平均降解速率計算公式為

自然降解率=(m0-m1)/m0×100%,

試驗菌降解率=(m1-m2)/m0×100%,

降解速率 =(m1-m2)/(n×t)。

其中：m0為培養基中加標的PAHs含量(ng)；m1為不接菌對照組7 d后的PAHs含量(ng)；m2為接入3株試驗菌培養7 d后的殘余PAHs含量(ng)；n為培養基中活菌數(CFU/mL)；t為降解時間(d)。

3株菌在作用同樣時間(7 d)后，同法測定其培養基中PAHs殘余含量，采用平板菌落計數法，同時測定每個樣品中的活菌數，用上述降解速率公式，計算出單位活細胞對4種PAHs的降解速率。

1.3 數據處理

試驗結果使用Agilent MassHunter Qualitalive Analysis、Alient MassHunter 軟件進行定量分析，應用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖對3株菌在PAHs-無機鹽培養基中生長的影響

從圖1～圖4可見：在無葡萄糖的4種PAHs-無機鹽培養基中，3種菌生長情況均較好的是萘-無機鹽培養基，S1、Y3和G12 菌株的菌量分別為4.12×109、3.12×109、2.00×109CFU/mL，說明3株菌均能較好地利用萘為碳源；無葡萄糖添加的其他3種PAHs-無機鹽培養基中，3株菌生長均較差，生長量依次為菲-無機鹽培養基、苯并[α]芘-無機鹽培養基和惹烯-無機鹽培養基。添加葡萄糖后，3株菌生長情況均有明顯提高，除苯并[α]芘-無機鹽培養基在1.5 g/L葡萄糖時較其他濃度組略有降低外，各葡萄糖濃度組均顯著高于不加糖組(P<0.05)；3株菌在萘、菲和惹烯3種PAHs培養基內生長量均與含糖量成正比，3株菌間比較顯示，S1菌株在不同濃度葡萄糖的萘、菲和惹烯培養基中生長量均最大，在0.5、1.0 g/L葡萄糖濃度的3種PAHs-無機鹽培養基和1.5 g/L葡萄糖濃度的惹烯-無機鹽培養基中均明顯優于Y3和G12菌株，且有顯著性差異(P<0.05)，而Y3菌株和G12菌株生長量則無顯著性差異(P>0.05)；G12菌株在不同濃度葡萄糖的苯并[α]芘-無機鹽培養基中生長量最大，但僅在1.0 g/L葡萄糖濃度時G12菌株生長量與S1菌株有顯著性差異(P<0.05)，其他濃度下3菌株生長量均無顯著性差異(P>0.05)。

注：標有不同大寫字母表示同一菌株不同葡萄糖濃度間生長量有顯著性差異(P<0.05)，標有不同小寫字母表示同一葡萄糖濃度不同菌株間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note：The means with different capital letters are significantly different at different glucose concentrations in the same strain at the 0.05 probability level; the means with different letters being significantly different in different strains at the same glucose concentration at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖1 3株菌在不同葡萄糖濃度的萘-無機鹽培養基中的生長情況Fig.1 Growth of 3 strains in naphthalene-mineral medium containing different concentrations of glucose

圖2 3株菌在不同葡萄糖濃度的菲-無機鹽培養基中的生長情況Fig.2 Growth of 3 strains in phenanthrene-mineral medium containing different concentrations of glucose

圖3 3株菌在不同葡萄糖濃度的惹烯-無機鹽培養基中的生長情況Fig.3 Growth of 3 strains in retene-mineral medium containing different concentrations of glucose

圖4 3株菌在不同葡萄糖濃度的苯并[α]芘-無機鹽培養基中的生長情況Fig.4 Growth of 3 strains in benzo [α] pyrene-mineral medium containing different concentrations of glucose

2.2 葡萄糖對3株菌降解速率的影響

2.2.1 試驗菌對萘的降解率及單位細胞的降解速率 經計算得出，萘在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機鹽培養基中7 d后，自然降解率分別為5.49%、8.57%、7.52%、6.84%。從圖5可見：不添加葡萄糖時，S1、Y3和G12菌株對萘的降解率分別為13.40%、19.92%、16.84%，且3株菌間無顯著性差異(P>0.05)；不同濃度葡萄糖可提高3株菌對萘的降解率，3株菌對萘的降解率在添加1.0 g/L葡萄糖時與無糖組和0.5 g/L葡萄糖組有顯著差異(P<0.05)，在1.0 g/L葡萄糖濃度時3株菌對萘的降解率依次為Y3(70.56%)>G12(67.82%)>S1(57.46%)。

圖5 3株菌對標準品萘的降解率Fig.5 Degradation proportion of 3 strains on naphthalene

從圖6可見：通過計算單個細胞對萘的降解速率得出，無葡萄糖添加時，S1菌株對萘的降解速率最高，達到5.606×10-8ng/(CFU·d)，G12菌株和Y3菌株對萘的降解速率依次為2.132×10-8、1.342×10-8ng/(CFU·d)，S1菌株與其他2株菌(Y3、G12菌株)相比有顯著性差異(P<0.05)，但Y3與G12菌株間無顯著性差異(P>0.05)；隨著葡萄糖濃度的增加，3株菌單個細胞的降解速率皆呈降低趨勢，其中S1菌株較無糖組顯著降低(P<0.05)，最低降至5.257×10-9ng/(CFU·d)，減小了一個數量級。

圖6 3株菌對標準品萘的降解速率Fig.6 Degradation efficiencies of 3 strains on naphthalene

2.2.2 試驗菌對菲的降解率及單位細胞的降解速率 經計算得出，菲在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機鹽培養基中7 d后，自然降解率分別為1.34%、1.76%、3.94%、3.34%。從圖7可見：無糖組中，G12菌株對菲的降解率最高(22.04%)，其次為Y3(17.33%)和S1菌株(11.24%)，且3株菌間無顯著性差異(P>0.05)；Y3、S1和G12菌株對菲的降解率在添加1.0 g/L葡萄糖時提升最顯著，分別為62.15%、60.51%、59.77%，且與無糖組和0.5 g/L葡萄糖組有顯著性差異(P<0.05)，各葡萄糖濃度下，3株菌間降解率無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 3株菌對標準品菲的降解率Fig.7 Degradation proportion of 3 strains on phenanthrene

從圖8可見：Y3菌株在無葡萄糖添加時，具有較高的菲降解速率[1.092×10-7ng/(CFU·d)]，與S1菌株[2.569×10-8ng/(CFU·d)]相比有顯著性差異(P<0.05)，與G12菌株[7.975×10-8ng/(CFU·d)]無顯著性差異(P>0.05)；隨葡萄糖濃度的增加，3株菌對菲的降解速率均呈下降趨勢，且均較無糖組顯著下降(P<0.05)，各葡萄糖濃度下，3株菌對菲的降解速率或同一葡萄糖濃度下不同菌株之間均無顯著性差異(P>0.05)。

圖8 3株菌對標準品菲的降解速率Fig.8 Degradation efficiencies of 3 strains on phenanthrene

2.2.3 試驗菌對惹烯的降解率及單位細胞的降解速率 經計算得出，惹烯在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機鹽培養基中7 d后，自然降解率分別為0%、3.79%、1.20%、1.49%。從圖9可見：無葡萄糖組，S1 、Y3和G12菌株對惹烯的降解率分別為0.05%、 5.18%和10.22%，且3株菌間有顯著性差異(P<0.05)，降解率依次為G12>Y3>S1；添加0.5 g/L葡萄糖濃度時，3株菌降解率均有所提高，降解率依次為G12>Y3>S1，與無葡萄糖添加相比，S1菌株對惹烯的降解率顯著提高(P<0.05)，Y3、G12菌株增加不顯著(P>0.05)；添加1.0 g/L葡萄糖時，3株菌對惹烯的降解率達到最高，降解率依次為Y3(66.49%)>G12(66.42%)>S1(66.18%)；添加1.5 g/L葡萄糖濃度時，3株菌的降解率與1.0 g/L時的降解率無顯著性差異(P>0.05)，且3株菌間也無顯著性差異(P>0.05)。

圖9 3株菌對標準品惹烯的降解率Fig.9 Degradation proportion of 3 strains on retene

從圖10可見：在無葡萄糖添加情況下，G12、Y3和S1菌株對惹烯的降解速率分別為3.859×10-7、1.012×10-7、6.835×10-8ng/(CFU·d)，G12菌株顯著高于S1和Y3菌株(P<0.05)；在添加不同濃度葡萄糖后，G12菌株對惹烯的降解速率顯著降低(P<0.05)，其他2株菌對惹烯的降解速率也顯著降低(P<0.05)，但幅度不如G12菌株，不同葡萄糖濃度下3株菌對惹烯的降解速率相差不大，同一葡萄糖濃度下不同菌株間也無顯著性差異(P>0.05)。

圖10 3株菌對標準品惹烯的降解速率Fig.10 Degradation efficiencies of 3 strains on retene

2.2.4 試驗菌對苯并[α]芘降解率及單位細胞的降解速率 經計算得出，苯并[α]芘在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機鹽培養基中7 d后，自然降解率分別為0.05%、0.06%、1.75%、1.86%。從圖11可見：無糖添加時，S1、Y3和G12菌株對苯并[α]芘的降解率分別為2.49%、5.46%和5.49%，且3株菌間無顯著性差異(P>0.05)；添加0.5 g/L葡萄糖濃度時，3株菌對苯并[α]芘的降解率顯著提高，降解率依次為S1>Y3>G12，但3株菌間降解率無顯著性差異(P>0.05)；1.0、1.5 g/L濃度組間的降解率和同一濃度下各菌株對苯并[α]芘的降解率均無顯著性差異(P>0.05)，最高分別為S1(71.91%)、Y3(71.25%)和G12菌株(70.50%)。

圖11 3株菌對標準品苯并[α]芘的降解率Fig.11 Degradation proportion of 3 strains on benzo [α] pyrene

從圖12可見：在無糖添加時，G12菌株對苯并[α]芘的降解速率為3株菌中最高，達到1.943×10-8ng/(CFU·d)，其次為Y3菌株，為1.244×10-8ng/(CFU·d)，S1菌株最低，為9.651×10-9ng/(CFU·d)；3株菌對苯并[α]芘的降解速率均隨葡萄糖添加量的增加呈下降趨勢，3株菌對苯并[α]芘的降解速率在加糖后均顯著低于不加糖組(P<0.05)，G12菌株在0.5 g/L和1.0 g/L葡萄糖時對苯并[α]芘的降解速率顯著高于其他2株菌(P<0.05)，在1.5 g/L葡萄糖時3株菌對苯并[α]芘的降解速率無顯著性差異(P>0.05)。

圖12 3株菌對標準品苯并[α]芘的降解速率Fig.12 Degradation efficiencies of 3 strains on benzo [α] pyrene

3 討論

3.1 試驗菌株對4種PAHs的降解性能

本研究中選用的3株菌中，S1菌株是翅堿蓬根系表面附著細菌，經鑒定為微桿菌屬Microbacteriumsp.，G12菌株是翅堿蓬根系內生菌，經鑒定為劉志恒菌Zhihengliuellsp.，Y3菌株為惡臭假單胞菌Pseudomonasputida，3株菌均耐鹽生長。3株菌在無糖的4種PAHs-無機鹽培養基中的生長狀況顯示，在萘-無機鹽培養基中生長狀況最好，在菲、惹烯、苯并[α]芘-無機鹽培養基中長勢較弱。分析其原因，可能與萘結構簡單易于分解有關[23]。添加葡萄糖后，3株菌在4種PAHs-無機鹽培養基中的生長量均有顯著增加，G12菌株在葡萄糖添加量為1.0 g/L的苯并[α]芘-無機鹽培養基中的生長量是無糖對照組的4倍，長勢優于S1和Y3菌株。S1菌株在無糖的萘和菲-無機鹽培養基中生長量高于其他2株菌，當葡萄糖添加量為1.0 g/L時，S1菌數與無糖添加時相比，分別增加了兩個數量級(菲)和一個數量級(萘)。因此，S1菌株對結構簡單的萘具有較好的利用性，G12菌株對結構復雜的苯并[α]芘有更好的利用性能，1.0 g/L葡萄糖即可顯著提高3株菌在4種PAHs-無機鹽培養基中的生長量。

對比4種PAHs的自然降解率和在含糖培養基中的降解率數據，萘的自然降解率最高，為5.49%，其他依次為菲、惹烯、苯并[α]芘，說明低分子量芳香烴較易在自然條件下被降解，而高分子量的苯并[α]芘較難以自行降解。培養基中加入不同濃度葡萄糖后，自然降解率有所改變，但差異不顯著。3株試驗菌在無糖添加時，均可有效降解4種PAHs，除S1菌株對惹烯的降解性能較差外，其他2株菌對惹烯的降解率與自然降解率比較，差異明顯。添加葡萄糖后可顯著提高3株菌對4種PHAs的降解率，雖然添加1.0、1.5 g/L葡萄糖濃度時3株菌的降解率均較高，但二者無顯著性差異，從經濟角度考慮，認為最適添加濃度為1.0 g/L。3株菌單位細胞降解速率結果顯示，3株菌在添加不同濃度葡萄糖時，單位細胞的降解速率出現明顯下降，且與葡萄糖濃度成反比關系。

目前，有關微生物降解PAHs的研究主要為土壤環境分離菌的相關報道，徐中陽等[24]、 廉景燕等[25]僅報道了不同種假單胞菌在3～4 d時對較高濃度加標萘的降解性能，而對耐鹽微生物對PAHs的降解性能研究較少。王慧等[14]利用5%鹽度礦物培養基(MSM)從石油污染土壤中富集分離出一株能降解多種PAHs的嗜鹽菌TSL5-2菌株，鑒定為海旋菌Thalassospirasp.，該菌在5%鹽度下25 d內，對菲、芘、熒蒽(初始質量濃度均為20 mg/L)、苯并蒽(初始質量濃度為8 mg/L)具有不同的降解率，但不能降解苯并[α]芘。王春明等[15]從勝利油泥中分離到的微桿菌3-28菌株Microbacteriumsp.3-28在萘、菲-無機鹽培養基中生長狀況較好，對萘、菲、蒽和芘均有較高的降解能力，單獨作用112 h后萘與菲完全降解，而蒽和芘28 d時的降解率分別為97.54%、90.2%，3-28菌株也能夠在鹽度為10～30 g/kg的環境中良好生長。本研究中,PAHs濃度設置為20 mg/L，無葡萄糖添加時，微桿菌S1對4種PAHs的降解率均較低，在添加葡萄糖后，S1對萘、菲、惹烯、苯并[α]芘的降解率均有大幅提高，這與微桿菌3-28有一定差別。綜上所述，土壤中存在的假單胞菌、微桿菌中的菌株具有降解不同PAHs的能力，同時能夠耐鹽生長。有關劉志恒菌(G12菌株)對PAHs降解性能的研究尚未見報道，尤其該菌株為翅堿蓬根系內生菌，因此，與翅堿蓬的相關性及在環境中的作用今后需要深入研究。另外，G12菌株的生物學特性目前也較少報道。本研究結果表明，該菌在無葡萄糖添加時，除對萘的降解率低于其他2株菌外，對菲、惹烯和苯并[α]芘的降解率明顯高于S1菌株。鑒于這2株菌均分離自翅堿蓬，因此，該菌株作為灘涂耐鹽植物共棲菌，可能在去除沿海沉積質中PAHs污染物方面具有潛在應用價值。

3.2 試驗菌株對PHAs降解的共代謝作用機理

自然界微生物對很多復雜有機物的降解均存在共代謝作用。微生物共代謝(cometabolism)作用機理包括3種形式：第一種，基本生長基質存在時，可為微生物代謝提供充足的碳源和能源，同時誘導微生物產生降解非生長基質的某些關鍵酶[26]；第二種，某些污染物在自然界中難于降解的根本原因在于微生物缺乏某些特定的關鍵酶或酶的活性不高[27]，如果微生物本身存在對這些物質的降解酶類，但酶活性并不高，從而使這種非生長基質不能有效利用，微生物生長緩慢，而共代謝物作為生長基質提供了基礎碳源和能源，促進了微生物的生長，群體的降解性能得到大幅度提升；第三種，在自然環境中或者混合培養中，微生物之間存在共酶效應，使得一種微生物部分分解的非生長基質成為其他種類微生物的生長基質，從而達到消除環境污染物的效果。

共代謝普遍存在于自然界不同環境中，當出現微生物難以直接利用的化合物時，其以不同的形式促進了環境污染物的降解。Chen等[28]運用假單胞菌，以菲為共代謝底物，對加標濃度為10 mg/L苯并[α]芘培養基作用48 h，苯并[α]芘的去除率為32%。鞏宗強等[29]在研究芘在土壤中的共代謝降解特性時發現，微生物對芘的自然降解作用較緩慢，一般半衰期為20 d，但加入共代謝底物后25 d時芘的降解率可達80%。李政等[30]采用假單胞菌等復合降油菌劑處理多環芳烴，發現單一多環芳烴的生物降解中，結構簡單的芴和菲的降解效果最好，在第7天時基本生成其他產物，而芘的降解效果最差。當3種多環芳烴混合降解時，芴、菲和芘分別在第3、5、8天時得到完全去除，呈現明顯的共代謝作用。近期刁碩等[16]報道了一株低溫耐鹽芘降解菌DYC-1菌株(紅球菌Rhodococcussp.)在高鹽和低溫狀況下，添加不同共代謝底物后對芘的降解特性結果顯示，葡萄糖、水楊酸和菲可顯著提高試驗菌株對芘的降解率，其中添加0.1 g/L葡萄糖時，降解率可達30%。

本研究結果顯示，在未添加基礎碳源(葡萄糖)時，3種菌對4種PAHs均具有一定的降解作用，葡萄糖添加后3株菌較無糖時對PAHs的降解率大幅度提升，添加1.0 g/L葡萄糖時，對萘的降解率分別提高了44.06%(S1)、70.56%(Y3)和50.98%(G12)，對菲的降解率分別提高49.66%(S1)、45.87%(Y3)和38.29%(G12)，對惹烯的降解率分別提高66.13%(S1)、61.31%(Y3)和56.20%(G12)，對苯并[α]芘的降解率分別提高69.42%(S1)、65.79%(Y3)和65.01(G12)，單個細胞降解速率均大幅度降低。據此認為，所采用的3株菌基本符合共代謝的第二個機理。從加糖后降解率提高的情況分析，結構相對復雜的惹烯和苯并[α]芘降解率提升幅度較大，因此，不能排除細胞內某種酶的活性發生改變，或某種酶被誘導產生的可能性，更為深入的分子機理有待下一步進行蛋白質組學和代謝組學的研究。

3.3 共代謝底物添加量對降解性能的影響

目前，土壤環境污染物的共代謝作用研究較多，包括多環芳烴的共代謝降解[31-32]。微生物對難降解有機物的共代謝基質因不同環境、不同微生物和不同底物而不盡相同。就多環芳烴而言，某些低分子的多環芳烴本身也可以作為復雜多環芳烴的共代謝基質[33-34]，不同共代謝底物使得微生物目標化合物的降解率也有所不同。葡萄糖作為最基本的共代謝基質對微生物降解復雜有機物有較確切的作用[17]。本研究中，葡萄糖的添加量根據前期研究工作中3株菌對柴油降解時葡萄糖的添加量而設計。陳芳艷等[35]在研究外加碳源條件下尖鐮孢菌對蒽的降解中發現，不同的葡萄糖濃度對蒽的降解情況有不同的影響，當葡萄糖濃度為1 mg/L時，蒽的含量變化較??；當葡萄糖濃度為5 mg/L時，蒽的去除率達到了95%；當葡萄糖濃度增加到20 mg/L時，蒽的降解率降為84.8%。據此認為，外源物質的添加量是調控底物共代謝性能的主要考察指標。在一定范圍內，微生物對有機污染物的降解率隨添加物含量的增加而提高。但超過一定劑量后，添加物的含量過高則抑制微生物的代謝活性乃至改變其生長狀態。本研究中，葡萄糖的加入量為0.5 g/L時，3株菌對4種PAHs的降解率與無糖對照相比提高不夠顯著，當葡萄糖添加到1.0 g/L時，3株菌對4種PAHs均顯著甚至極顯著的提高，但葡萄糖添加1.5 g/L與1.0 g/L時相比差異并不顯著，建議在實際應用中，葡萄糖添加量選用1 g/L或1 g/kg。

共代謝基質的添加是今后海洋多環芳烴污染修復中一個重要強化措施，本研究中所采用的3株菌中，S1和G12菌株分離自翅堿蓬，與翅堿蓬根系有較好的可接受性，可作為強化定植菌種用于構建降油菌-翅堿蓬復合載體，Y3菌株也可用于根際土壤強化，形成降油細菌-植物修復系統，應用于海洋灘涂沉積質中石油類和多環芳烴類污染物的去除，同時以科學的方法添加共代謝底物，達到高速率的修復效果。在海洋環境多環芳烴的修復過程中，共代謝基質的類型、添加量和添加方式是今后需要深入研究的問題。鑒于海洋環境多環芳烴污染的生物修復目前仍處于起步階段，菌種的選擇、環境影響因素、共代謝底物類型和降解菌共代謝的分子機理等均有待于深入的研究，力求能夠較系統地探明有關科學問題，有效采用生物修復技術解決海洋環境多環芳烴污染狀況。