劉海琴
(鶴壁市畜產品質量監測檢驗中心,河南鶴壁 458000)
畜禽肉(雞肉)中殘留的氟喹諾酮類藥物(環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星)用磷酸鹽緩沖液提取,經HLB固相萃取柱凈化,流動相洗脫后。用液相色譜-熒光檢測器測定,外標法定量。
安捷倫1100液相色譜儀-配熒光檢測器,
分析天平 感量0.00001g.
R-201旋轉蒸發儀,
VX-2渦旋振蕩器,
Eppendorf移液器(成套),3~30k高速冷凍離心機,固相萃取裝置, HLB固相萃取柱.
(1)磷酸鹽緩沖液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水溶解并稀釋500ml,用5.0mcl/ml氫氧化鈉溶液調節(pH=7.0)
(2)磷酸/三乙胺溶液(0.05mcl/l)取85%磷酸3.4 ml,用水稀釋至1000ml,用三乙胺調節pH=2.4.
(1)分別稱取鹽酸環丙沙星、甲磺酸達氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星對照品各約25mg,精密稱定,分別于25ml棕色容量瓶中,用0.03mcl/l氫氧化鈉溶液稀釋成濃度分別為1mg/ml的儲備液。(達氟沙星儲備液濃度配制成0.2mg/ml)
(2)混合標準中間液 分別量取1mg/ml(0.2mg/ml)的儲備液各0.1ml于50ml容量瓶中,用流動相稀釋成濃度為2μg/ml(0.4ug/ml)的混合標準中間液。
3.3.1 質量控制樣品的制備
(1)空白樣品:取空白試樣,與待測樣品同步處理。
(2)添加樣品:取空白樣品,添加2μg/ml(0.4μg/ml)的混合標準中間液0.1ml,制的濃度為100μg/kg的陽性添加試料,與待測樣品同步處理。
3.3.2 提取
(1)取勻漿的試料2±0.02g,置50ml離心管中,加磷酸鹽緩沖液10.0ml,渦旋混合,中速震蕩5min,14000r/min離心10min,傾取上清液。(磷酸鹽緩沖液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水溶解并稀釋500ml,用5.0mcl/ml氫氧化鈉溶液調節pH=7.0)
(2)用磷酸鹽緩沖液10.0ml重復提取一次。合并兩次上清液,備用。
3.3.3 凈化
(1)固相萃取柱依次用甲醇2ml,磷酸鹽緩沖液2ml預洗。
(2)取上述備用液體5.0ml過柱。
(3)用水2ml洗柱,擠干。
(4)用流動相2.0ml洗脫,收集,擠干,渦旋混合。過0.22μm微孔濾膜,供上機測定。
3.3.4 系列標準工作液的制備
精密量取混合標準中間工作液,用流動相稀釋成濃度為5、
10、20、50 、100、200、500ng/ml的系列標準工作液。系列標準工作溶液按表1配制。
表1 系列標準工作溶液配制
色譜柱:C18(4.6×150mm 5μm);
柱溫:30℃;
流動相:0.05mcl/l磷酸溶液/三乙胺-乙腈(87+13);
流速:1.0ml/min;
進樣量:20μl;
檢測波長:激發波長280nm;發射波長450nm。
20ng/ml 標準溶液中氟喹諾酮類藥物色譜圖
100μg/kg空白雞肉添加試樣中氟喹諾酮類藥物色譜圖
3.5.1 線性范圍
取濃度為5~500ng/ml 氟喹諾酮類藥物系列標準工作液進樣,以峰面積為縱坐標,以藥物濃度為橫坐標繪制標準工作曲線。結果表明(見表1),在5~500ng/ml系列標準工作液濃度范圍內,喹諾酮類藥物峰面積與濃度呈良好的線性關系。
表2 喹諾酮類藥物的線性方程、相關系數
3.5.2 準確度和精密度的測定
稱取同一來源的空白雞肉樣品3份,每份2.0g,分別添加2μg/ml(0.4μg/ml)的喹諾酮類藥物溶液0.1ml,制備濃度為100μg/kg(達氟沙星20μg/kg)的陽性樣品,按本方法測定,計算回收率在73.1%~84.54%,標準偏差在1.84%~5.4%,表明本方法重復性較好,具體結果見表3。
表3 喹諾酮類藥物的回收率試驗結果
實驗表明,雞肉樣品經磷酸鹽緩沖液提取后,經固相萃取柱凈化后,采用液相-熒光檢測器法測定,外標法定量,回收率為73.1%~84.5%,相對標準偏差為1.8%~5.4%(n=3).本方法系列標準工作液濃度范圍內,喹諾酮類藥物峰面積與濃度呈良好的線性關系,準確度好、近年以來經過對各類動物組織檢測的結果表明,該方法具有簡便、快速、靈敏、準確的特點,可滿足市級檢測單位對動物組織中4種喹諾酮類藥物殘留日常檢測需要。