秋末刈割對沙地苜蓿冬季根頸抗氧化酶活性及脯氨酸含量的影響

朱愛民， 張玉霞， 王顯國， 田永雷

(1. 內蒙古民族大學， 內蒙古通遼 028041； 2. 中國農業大學動物科技學院，北京 100083)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為優質的多年生豆科牧草(Leguminosaesp.)[1]，在我國生態環境建設和畜牧業生產中發揮著重要作用[2]?？茽柷叩貐^在氣溫較低的年份紫花苜蓿普遍有凍害現象，直接制約該地區苜蓿產業的發展。國內外有關苜?？购矫娴难芯抠Y料[3-8]很多，研究表明紫花苜?？购芰Φ拇笮∨c其根系中保護酶活性密切相關[9-10]，過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)是酶促防御系統的重要保護酶類，對于維護細胞膜系統的穩定性具有重要作用，對苜?？购Φ奶岣哂刑厥庖饬x[11-13]，其活性的變化可作為植物的耐寒指標[14-16]。

刈割是人工草地有效利用的重要措施之一，合理刈割對苜蓿的安全越冬和再生具有重要意義[17]，刈割與苜蓿根系特征[18-19]及根頸氧化酶活性關系密切，有學者如Silkett[20]、Grand-field[21]、Jackobs[22]等認為第一次殺霜(殺霜日是指氣溫首次降至-20C )之前4～6周，是中、高維度地區紫花苜蓿刈割秋季敏感期。在該時段刈割紫花苜蓿導致草地持久性和隨后年份草產量降低。但Reynolds[23]、Mays等[24]認為當苜蓿品種秋眠和抗病性強、土壤肥力高、刈割次數和生育時期(或間隔期)適宜，秋季刈割不會造成草地持久性和產草量降低。有關刈割的爭議，究竟孰是孰非，需要更多的研究去佐證。孫浩等[25]在2015年對阿魯科爾沁旗最佳末次刈割期研究中表明，末茬秋季敏感期刈割導致苜蓿越冬率將低，但未對苜蓿根頸中抗氧化物酶活性和滲透調節物質變化做深入研究，苜蓿根頸中抗氧化物酶活性在植物越冬期間存在怎樣的變化規律及與越冬有無直接聯系還需進一步探究。

本試驗通過在科爾沁地區對8個苜蓿品種秋季敏感兩時期刈割處理同未刈割對照，探究苜蓿根頸中抗氧化物酶活性及游離脯氨酸變化，分析科爾沁沙地秋末是否應該刈割及最佳刈割時期，為解決科爾沁沙地苜蓿末茬刈割及越冬問題提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區自然概況

試驗地設在內蒙古自治區赤峰市阿魯科爾沁旗草源合作社公司，地理位置東經116°21′～120°58′，北緯41°17′～45°24′，溫帶半干旱大陸性氣候。年平均氣溫0～6℃，≥10℃積溫3 000～3 200℃，無霜期140～150天，年平均降水量350～400 mm，蒸發量是降水量的5倍左右，年平均風速3～4.4 m·s-1。試驗田土壤為沙土，新開墾草地。

1.2 試驗材料

供試材料如表1所示。

1.3 試驗方法

小區布局及管理：采用隨機區組設計，小區試驗面積20m2(5m×4m)，8個品種，3次重復，共設24個小區，小區之間設50 cm過道。所有小區底肥均施750 kg·hm-2安琪有機肥、300 kg·hm-2過磷酸鈣、7 kg·hm-2硫酸鉀、60 kg·hm-2尿素(機施)，播量22.5 kg·hm-2，8月4日播種，人工撒播，試驗田正常管理。

表1 紫花苜蓿品種及來源Table 1 Alfalfa varieties and sources

刈割處理：分別于10月1號和10月15號兩秋季敏感期對每小區4 m×1.5 m進行刈割并標記，未刈割作為對照。

取樣時期：分別于土壤凍融交替時期(秋冬晚上溫度低于0℃土壤凍結與白天溫度大于0℃，土壤凍融交替出現的時期)、土壤封凍期(冬季全天溫度低于0℃，土壤完全凍結的時期)取樣，并測定相關指標。

1.4 測定項目及方法

每處理隨機挖取長勢良好且根頸粗度一致的紫花苜蓿根系30株，于實驗室中用蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸出根系表面的水分，用刀片對根頸部進行切片、備用，進行試驗：游離脯氨酸用茚三酮法測定；丙二醛用硫代巴比妥酸法測定；POD用愈創木酚法測定；SOD用氮藍四唑法測定；CAT用紫外吸收法測定。

1.5 數據分析

試驗數據用Microsoft Excel 軟件處理并做表格，SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中SOD活性的影響

根據表2可知，土壤凍融交替期，未刈割苜蓿根頸中SOD活性顯著高與10月1號刈割苜蓿根頸中SOD活性(P<0.05)，除‘龍牧801’和‘公農1號’品種外未刈割苜蓿根頸中SOD活性顯著高于10月15號刈割苜蓿根頸中SOD活性(P<0.05)。10月15號刈割的苜蓿根頸中SOD活性均顯著高于10月1號刈割的根頸中SOD活性。不同時期刈割苜蓿不同品種間根頸中SOD活性強度不同：未刈割和10月15號刈割，‘龍牧801’、‘農菁1號’、‘農菁8號’苜蓿根頸中SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割，‘龍牧801’、‘東苜1號’、‘公農號’和‘農菁1號’根頸中SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；無論是未刈割還是不同時期刈割‘草原2號’品種苜蓿根頸中SOD活性與其他品種相比較弱。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中SOD活性均顯著高于不同時期刈割苜蓿根頸中SOD活性(P<0.05)，10月15號刈割的苜蓿根頸中SOD活性高于10月1號刈割苜蓿根頸中SOD活性，但是只有‘東苜1號’、‘公農1號’、‘農菁1號’、‘農菁8號’SOD活性變化達到顯著水平(P<0.05)。不同品種間根頸中SOD活性有明顯差異：未刈割‘農菁8號’苜蓿根頸中SOD活性顯著低于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割，‘肇東’、‘草原2號’及‘公農1號’苜蓿根頸中SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05)，‘農菁8號’品種根頸中SOD活性最低；10月15號刈割，公農一號苜蓿根頸中SOD活性最強，且顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，‘農菁1號’和‘草原3號’品種根頸中SOD活性顯著低于其他品種(P<0.05)。

表2 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中SOD活性的影響Table 2 Effect of cutting on the activity of SOD in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·g-1 FW

注：不同小寫字母表示差異顯著性水平P< 0.05，“/”左邊表示同列相同時期測定不同苜蓿品種間差異顯著性，右邊表示同一品種刈割處理差異顯著性，下同

Note: The different letters indicate significant differences at the 0.05 level, On the left side of‘/’ indicate significant difference of the same column among different alfalfa varieties that determined at the same time ,On the right side of‘/’ indicate significant difference of the same variety betwen cutting treatments. The same as below

2.2 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中POD活性的影響

由表3可知，秋末不同時期刈割處理對8個苜蓿品種根頸中POD活性影響不同，不同苜蓿品種間根頸中POD活性強度不同。

土壤凍融交替期，10月1號刈割苜蓿根頸中POD活性均顯著高于未刈割和10月15號刈割根頸中POD活性(P<0.05)；未刈割苜蓿根頸中POD活性均顯著高于10月15號刈割根頸中POD活性(P<0.05)。未刈割苜蓿，‘公農1號’根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割和10月15號刈割‘公農1號’、‘東苜1號’根頸中POD活性均顯著高于其他品種(P<0.05)。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中POD活性顯著高于不同時期刈割苜蓿根頸中POD含量(P<0.05)；10月1號刈割除‘農菁1號’和‘農菁8號’外其他苜蓿根頸中POD活性均顯著高于10月15號刈割根頸中POD含量(P<0.05)。未刈割‘農菁1號’、‘農菁8號’、‘東苜1號’苜蓿根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割‘東苜1號’苜蓿根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；10月15號刈割‘農菁1號’、‘農菁8號’根頸中POD活性顯著高于其他品種(P<0.05)；無論未刈割還是不同時期刈割‘龍牧801’和‘草原3號’根頸中POD含量均顯著低于其他苜蓿品種(P<0.05)。

表3 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中POD活性的影響Table 3 Effect of cutting on the activity of POD in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·min-1·g-1 FW

2.3 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中CAT活性的影響

根據表4可知，土壤凍融交替期測定結果表明未刈割與不同時期刈割苜蓿根頸中CAT活性均無顯著性差異。未刈割、10月1號刈割、10月15號刈割‘龍牧801’苜蓿根頸中CAT活性均是最高，與其他品種比較差異顯著(P<0.05)，無論是未刈割還是不同時期刈割‘農菁8號’苜蓿根頸中CAT活性均較弱。

土壤封凍期，10月1號刈割苜蓿根頸中CAT活性顯著高于未刈割和10月15號刈割苜蓿根頸中CAT活性(P<0.05)，除‘公農1號’外未刈割苜蓿根頸中CAT活性均顯著高于10月15號刈割苜蓿根頸中CAT活性(P<0.05)。未刈割‘東苜1號’、‘草原2號’苜蓿根頸中CAT活性顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)，草原3號苜蓿根系中CAT活性顯著低于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月1號刈割‘肇東’、‘草原2號’苜蓿根頸中CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，‘農菁8號’苜蓿根頸中CAT活性顯著低于其他品種(P<0.05)；10月15號刈割‘公農1號’品種根頸中CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05)，‘草原3號’苜蓿根頸中CAT活性最弱，與其他品種相比，差異性顯著(P<0.05)。

表4 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中CAT活性的影響Table 4 Effect of cutting on the activity of CAT in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·min-1·g-1 FW

2.4 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中丙二醛含量的影響

由表5可知，土壤凍融交替期，10月1號刈割苜蓿根頸中丙二醛含量顯著高于10月15號刈割苜蓿根頸中MDA含量(P<0.05)，與未刈割苜蓿相比除‘肇東’、‘公農1號’品種外其他品種MDA含量均顯著增加(P<0.05)。未刈割苜蓿根頸中MDA含量高于10月15號刈割苜蓿根頸中MDA含量，但只有‘肇東’和‘公農1號’苜蓿根頸中MDA含量變化達到顯著水平(P<0.05)。未刈割‘農菁8號’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月1號刈割‘農菁8號’、‘草原3號’和‘龍牧801’根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；10月15號刈割‘農菁1號’、‘農菁8號’及‘龍牧801’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；未刈割10月1號刈割及10月15號刈割根頸中MDA含量最低的苜蓿品種分別是‘東苜1號’、‘公農1號’、‘肇東’(P<0.05)。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中MDA含量顯著高于10月1號刈割苜蓿根頸中MDA含量(P<0.05)，與10月15號刈割相比苜蓿根頸中MDA含量變化不顯著。10月15號刈割苜蓿根頸中MDA含量顯著高于10月1號刈割根頸中MDA含量(P<0.05)。未刈割和10月15號刈割‘農菁1號’、‘農菁8號’、‘草原2號’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；10月1號刈割‘農菁1號’、‘農菁8號’、‘草原2號’、‘草原3號’苜蓿根頸中MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)；未刈割與不同時期刈割肇東和東苜1號苜蓿根頸中MDA含量相比其他品種顯著降低(P<0.05)；

表5 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中MDA含量的影響Table 5 Effect of cutting on the content of MDA in the root neck of 8 alfalfa varieties/ nmol.ml-1FW

2.5 秋末刈割處理對8個苜蓿品種根頸中游離脯氨酸含量的影響

土壤凍融交替期測定結果表明，如表6所示，未刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于10月1號刈割和10月15刈割苜蓿根頸中含量(P<0.05)。10月1號刈割苜蓿根頸游離脯氨酸含量高于10月15號刈割苜蓿根頸中含量，但只有‘農菁1號’和‘農菁8號’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量變化達到顯著差異水平(P<0.05)。不同品種間未刈割、10月1號刈割和10月15號刈割根頸中游離脯氨酸含量最高的分別是‘東苜1號’、‘龍牧801’、‘龍牧801’，含量最低的分別是‘草原2號’、‘農菁1號’、‘農菁1號’。

土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于10月1號刈割苜蓿根頸中脯氨酸含量(P<0.05)，與10月15號刈割相比僅‘草原2號’和‘草原3號’差異達到顯著水平(P<0.05)；10月1號刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量除‘草原2號’和‘草原3號’外其他品種均顯著低于10月15號刈割根頸中脯氨酸含量(P<0.05)。未刈割‘肇東’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月1號刈割‘肇東’、‘公農1號’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)；10月15號刈割‘龍牧801’、‘肇東’、‘東苜1號’苜蓿根頸中游離脯氨酸含量較其他苜蓿品種高，差異顯著(P<0.05)；未刈割、10月1號刈割和10月15號刈割根頸中游離脯氨酸含量最低的分別是‘草原3號’、‘農菁8號’和‘草原2號’。

表6 刈割處理對8個苜蓿品種根頸中游離脯氨酸含量的影響Table 6 Effect of cutting treatment on free proline content in root neck of 8 alfalfa varieties/ μg·g-1 FW

3 討論與結論

3.1 秋末刈割處理對沙地苜蓿根頸中抗氧化酶活性的影響

研究表明逆境脅迫因素可誘發植物組織細胞內產生過量的H2O2等活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS 過剩積累會造成膜系統、蛋白質和 DNA 分子結構等損傷。為抵御 ROS 對細胞的毒害，植物細胞便啟動一些活性氧清除機制[26]，SOD、POD、CAT 是植物體內清除過量活性氧的重要酶促防御系統，可減輕或避免植物體的氧化損傷，抗寒性和耐刈割苜蓿品種在逆境條件下能維持較高的SOD、CAT 和 POD 等酶的活性，以利于清除超氧陰離子，降低膜質過氧化水平，從而減輕膜傷害程度[27]。季楊[28]等研究表明在逆境條件下鴨矛根系中SOD、POD酶活性增強。本試驗研究表明，刈割后紫花苜蓿根頸中SOD活性較未刈割均明顯減弱，推測刈割后苜蓿的抗逆性減弱。土壤凍融交替期，10月1號刈割苜蓿根頸中POD活性顯著大于未刈割和10月15號刈割根頸中POD活性，可能由于取樣測定時間和刈割時間長短有關，10月1號刈割后當白晝溫度大于5℃時苜蓿仍繼續再生，根系中POD活性逐漸增強，10月15號刈割距測定時期較短，晝夜溫度逐漸降低，苜蓿進入休眠，苜蓿根頸中POD活性下降。土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中POD活性顯著高于不同時期刈割苜蓿根頸中POD活性，土壤封凍后苜蓿根系已進入休眠狀態，根頸中各物質處于穩定狀態，此時未刈割苜蓿根頸中POD活性強，推斷未刈割苜?？购詮娪诓煌瑫r期刈割苜蓿。譚淑端等[29]研究表明，持續逆境脅迫下雙穗雀稗根系POD活性持續增加，劉建新[30]等研究表明，逆境脅迫下燕麥葉片中SOD、POD、CAT活性顯著增加。本試驗中，土壤凍融交替期，未刈割和不同時期刈割苜蓿根頸中CAT活性無顯著差異；土壤封凍期，10月1號刈割苜蓿根頸中CAT活性顯著高于未刈割和10月15號刈割苜蓿根頸中CAT活性，出現這種差異的原因是由于土壤封凍期溫度晝夜均低于0℃，刈割和低溫雙重因素導致苜蓿根系中產生大量超氧陰離子，從而誘導苜蓿啟動CAT保護機制，根系中CAT活性顯著增加，協同SOD和POD作用將超氧陰離子分解為H2O和O2。這與彭淼等[31]研究一致，其研究表明SOD 作為抵御活性氧傷害的“第一道防線”能使 O2發生歧化作用而轉化為H2O2，而 SOD 與H2O2清除酶 POD 和 CAT 的平衡對維持細胞功能至關重要，一般認為，其協調作用使細胞內活性氧維持在較低的水平。

3.2 秋末刈割處理對沙地苜蓿根頸中MDA含量的影響

丙二醛能抑制細胞保護酶的活性和降低抗氧化物的含量，是膜質過氧化的最終分解產物[32]。許多研究都將MDA含量作為衡量植物耐旱性強弱的一個重要指標[33-35]，張紅萍等[36]研究指出隨著逆境條件的加劇，丙二醛的含量也會逐漸增加。本試驗與其研究結果一致，土壤凍融期，10月1號刈割苜蓿根頸中MDA含量大于未刈割苜蓿根頸中含量，且均顯著大于10月15號刈割苜蓿根系中含量，這可能與苜蓿刈割后根頸抗逆性下降，苜蓿根頸細胞膜脂過氧化有關。土壤封凍期，10月1號刈割由于苜蓿根頸中CAT活性顯著增強，協同SOD、POD共同作用清除自由基，所以此時測得MDA含量顯著降低；10月15號刈割后隨著溫度的降低苜蓿進入休眠，此時根頸中物質含量維持在較穩定的范圍，所以土壤封凍期測得苜蓿根系中MDA含量與未刈割根頸中含量相比無差異顯著性。

3.3 秋末刈割處理對沙地苜蓿根頸中游離脯氨酸含量的影響

目前針對脯氨酸的積累與抗寒性是否相關還存在爭議，有些學者認為逆境環境下植物體內脯氨酸的積累是其對逆境環境的適應反應[37]，但有學者認為脯氨酸的積累是由逆境脅迫造成的傷害結果[38]，本試驗表明土壤凍融交替期和土壤封凍期，未刈割苜蓿根頸中游離脯氨酸含量均高于不同時期刈割根頸中含量。未刈割較刈割苜蓿受逆境脅迫小，而游離脯氨酸含量反而增加，所以推斷逆境條件下植物體內脯氨酸的積累是其對逆境的適應反應，且未刈割苜蓿較刈割苜蓿適應低溫脅迫能力強。

本研究初步結論為：進入寒冬，刈割與未刈割相比，未刈割苜蓿根頸中SOD、POD活性增強，游離脯氨酸含量增加，適應低溫環境能力強，秋末敏感期刈割刺激苜蓿根頸中CAT活性增強，但SOD、POD活性較低，游離脯氨酸含量下降，適應低溫環境能力弱，因此不建議秋末敏感期刈割。