白藜蘆醇通過激活Caspase-3和PARP-1影響前列腺癌細胞侵襲和凋亡

袁逾喆，張忠泉，孫慶紅，聶建軍

0 引言

前列腺癌是臨床常見的男性生殖系統上皮性惡性腫瘤[1]，其發病率較高，有報道，僅2010年美國前列腺癌的新增病例為21.8萬例[2]，我國前列腺癌的發病率遠低于西方國家，但隨著生活方式的西化和飲食結構的變化，我國前列腺癌的發病率逐年攀升，2012年我國腫瘤登記地區前列腺癌的發病率為9.92/100 000，居于男性惡性腫瘤的第6位[3]，預計到2050年，前列腺癌的發病率將增加2.5倍[4]。前列腺癌的致死率較高，嚴重威脅男性患者身體健康和生命安全。因此，探究安全高效的治療前列腺癌的藥物是醫學工作者研究的重點。

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種重要的植物抗毒素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎的作用[5]。近年研究表明，Res在腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡過程中發揮著重要作用[6]。本研究以人前列腺癌系PC-3為研究對象，探究白藜蘆醇對前列腺癌細胞侵襲和凋亡的影響及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人前列腺癌系PC-3由中國科學院上海細胞生物學研究所提供。

1.1.2 主要試劑與材料 DMEM培養基購自美國GIBCO公司；TRIzol reagent購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和實時定量試劑盒購自英國NEB公司；鼠抗人MMP-9多克隆抗體購自艾比瑪特醫藥科技(上海)有限公司；24孔細胞培養板和Transwell小室購自美國Corning公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司；奧林巴斯熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Biosciences FACSAriaⅢ流式細胞儀購自美國BD；熒光定量PCR儀器購自德國Eppendorf；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將購買的人前列腺癌PC-3解凍復蘇，加入2～3 ml胰蛋白酶液消化處理后，制成細胞懸浮液，按細胞數目1×106/ml接種于DMEM培養基中(10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養箱中培養，培養過程中更換細胞培養液，待細胞長滿瓶底85%左右時，棄去培養液，加入胰蛋白酶消化處理后，進行傳代培養和細胞凍存。

1.2.2 細胞分組及處理 取凍存的人前列腺癌PC-3，加入2 ml 0.25%的胰蛋白酶液消化處理，并制成單細胞懸浮液，調整細胞數目為1×106/ml接種于48孔細胞培養板(100 μl/孔)，待細胞融合度達到90%左右時，將細胞分成5組，每組重復8孔，命名為對照組、Z-DEVD-FMK組、Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組。Z-DEVD-FMK組：用100 μmol/L Z-DEVD-FMK培養細胞；Res低劑量組：在Z-DEVD-FMK組基礎上，用20 μmol/L Res培養細胞；Res中劑量組：在Z-DEVD-FMK組基礎上，用60 μmol/L Res培養細胞；Res高劑量組：在Z-DEVD-FMK組基礎上，用100 μmol/L Res培養細胞；對照組：加入等量的DSMO，每組細胞均培養48 h。

1.2.3 qRT-PCR檢測人前列腺癌PC-3中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平 用TRIzol reagent提取人前列腺癌PC-3的總RNA，并將其反轉成cDNA，根據NCBI上提交的Caspase-3(GI:16516816)和PARP-1(GI:156523967)的理論序列設計引物，Caspase-3：上游引物F1：5′-GGAAGCGAATCAATGGACTC-3′，下游引物R1：5′-CTCAGAAGCACACAAACAAAA-3′；PARP-1：上游引物F2：5′-AGGCATCAGCAATCTATCAGG-3′，下游引物R2：5′-GAGAAGGCATCTGCATTTTTTAATC-3′；以GAPDH為內參進行qRT-PCR。反應體系：5×緩沖液10 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，上游引物F 2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；反應條件：預變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：63 ℃ 15 s，40個循環，延伸時讀取光密度(D)值，采用最大二階導數法(2-△△Ct)對數據進行統計，計算Caspase-3和PARP-1 mRNA的相對表達量。

1.2.4 Transwell小室檢測人前列腺癌PC-3侵襲能力 用DMEM培養基將Matrigel膠稀釋至1 mg/ml，然后取40 μl均勻鋪于Transwell小室上室，37 ℃靜置30 min。取各組人前列腺癌PC-3，消化處理后制成單細胞懸液，調整細胞數目為1×106/ml，按每孔100 μl加入到Transwell小室，常規培養48 h后取出小室，棄去培養液，用PBS溶液清洗細胞，每孔加入500 μl 95%酒精固定15～20 min，經0.1%結晶紫溶液染色30 min后，用棉簽擦拭未穿膜細胞，風干后置于顯微鏡觀察，并記錄侵出小室細胞數目，以此作為評判細胞侵襲能力的指標。

1.2.5 Hoechst33258染色檢測人前列腺癌PC-3凋亡情況 取各組生長良好的對數期細胞，接種于6孔細胞培養板，待細胞長滿瓶底的80%時，棄去培養液，加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，棄去固定液，用PBS溶液洗滌細胞2～3次，加入500 μl Hoechst33258染液，染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察前列腺癌細胞PC-3細胞核著色情況。

1.2.6 流式細胞術檢測人前列腺癌PC-3凋亡情況 培養結束后，用PBS洗滌細胞2～3次后，用胰蛋白酶消化細胞2～3 min，加入75%乙醇于4 ℃下過夜固定細胞，用PBS漂洗細胞，置于超低溫離心機2 000 r/min離心10 min，棄去上清，此過程重復2～3次；加入10 μl RNA酶在37 ℃下孵育30 min，用10 μl PI進行染色，然后在黑暗中4 ℃孵育30 min。使用流式細胞儀進行數據采集和分析，使用ModFit LT軟件進行凋亡細胞百分比計算。

1.2.7 Western blot檢測PC-3細胞中MMP-9表達情況 加入細胞裂解液提取人前列腺癌PC-3細胞總蛋白，將蛋白樣品進行加熱煮沸和離心。以GAPDH為內參，取20 μl蛋白質樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結束后，半干轉膜儀轉膜50 min，滴加鼠抗人MMP-9多克隆抗體，置4 ℃下過夜，滴加二抗，37 ℃放置1 h。加入ECL發光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統采集圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對SDS-PAGE電泳圖目的條帶進行掃描，分析MMP-9的表達水平。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測人前列腺癌PC-3中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平 qRT-PCR檢測結果顯示，Z-DEVD-FMK組PC-3細胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平顯著高于對照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平顯著提高，呈劑量依賴性，結果見表1。

表1 各組人前列腺癌PC-3中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平比較

注：*與對照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

2.2 Transwell小室檢測人前列腺癌PC-3侵襲能力 Transwell小室檢測結果顯示，Z-DEVD-FMK組PC-3細胞侵襲能力高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細胞侵襲能力低于對照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，PC-3細胞侵襲能力顯著降低，呈劑量依賴性，結果見表2。

表2 各組侵出Transwell小室的人前列腺癌PC-3細胞數目

注：*與對照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

2.3 Hoechst33258染色檢測前列腺癌細胞PC-3凋亡情況 熒光顯微鏡檢測結果顯示，與對照組相比，Z-DEVD-FMK組細胞核染色質均勻分布，呈現均勻的弱藍色熒光，經Res處理后，細胞核內染色質固縮，呈現藍色熒光，隨著Res劑量的增加，發出亮藍色熒光的細胞數目逐漸增多，結果如圖1所示。

2.4 流式細胞儀檢測人前列腺癌PC-3凋亡情況 流式細胞儀檢測結果顯示，Z-DEVD-FMK組PC-3細胞凋亡率顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細胞凋亡率顯著高于對照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，PC-3細胞凋亡率顯著提高，呈劑量依賴性，結果見表3。

表3 各組人前列腺癌PC-3凋亡率比較

注：*與對照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

圖1 Hoechst33258染色檢測前列腺癌細胞PC-3凋亡情況

2.5 Western blot檢測PC-3細胞中MMP-9表達情況 Z-DEVD-FMK組PC-3細胞中MMP-9表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細胞中MMP-9表達水平低于對照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，MMP-9表達水平顯著降低，呈劑量依賴性，結果見表4。

表4 各組PC-3細胞中MMP-9相對表達量

注：*與對照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

3 討論

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，具有發病率高的特點，其在中國的發病率僅次于肺癌，居于第2位[7]，嚴重影響男性患者的身體健康和生命安全[8]。目前，臨床治療前列腺癌的主要方法有手術治療和放、化療[9-10]，放、化療具有很大的不良反應，給患者帶來極大的痛苦，對于已經發生轉移的中晚期前列腺癌患者，手術治療不能有效切除病灶，因此，嚴重影響患者治愈率及預后[11-12]。有報道，局限性前列腺癌的5年生存率為100%，而轉移性前列腺癌的5年生存率為31%[13]，因此，探究能夠抑制前列腺癌細胞侵襲和轉移、誘導前列腺癌細胞凋亡的藥物是提高前列腺癌患者生存率的關鍵環節。

Res是一種多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、藜蘆和鳳梨等70多種植物中，其中以葡萄皮中Res的含量最高，約為50～100 μg/g[14]。研究表明，Res具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎和神經保護等多種生物學功能[15]。李偉等[16]研究表明，Res能夠通過調控表皮生長因子受體的表達抑制胰腺癌細胞PANC-1和BxPC-3增殖，同時通過下調胰腺癌細胞中促存活蛋白Mcl-1的表達，進而誘導胰腺癌細胞凋亡。孫大鵬等[17]研究表明，Res能夠下調乳腺癌細胞MDA-MB-231中c-PLIP蛋白的表達，進而抑制乳腺癌細胞的生長和侵襲。鐘鳴駿等[18]研究表明，Res能夠抑制皮膚鱗狀癌細胞Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13增殖，將其細胞周期阻滯在G1期。謝進東等[19]用不同濃度的Res處理去勢抵抗型前列腺癌細胞系22RV1，結果表明，Res通過下調去勢抵抗型前列腺癌細胞中Bcl-2蛋白的表達，同時上調去勢抵抗型前列腺癌細胞中Bax蛋白的表達，進而抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，以上研究均提示，Res在腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡過程中發揮著重要作用。

本研究表明，Res組PC-3細胞侵襲能力顯著低于對照組，Res組PC-3細胞凋亡率顯著高于對照組，呈劑量依賴性，差異均有統計學意義，提示Res能夠抑制人前列腺癌PC-3細胞的侵襲能力，并誘導細胞凋亡。

Res在人前列腺癌PC-3細胞侵襲和凋亡過程中發揮著重要作用，但其作用機制尚未完全明確。MMP-9在細胞外基質降解過程中發揮著重要的作用，與細胞侵襲和轉移密切相關，張莉等[20]采用免疫組化檢測不同前列腺癌組織中MMP-9的表達水平，同時采用Boyden小室侵襲實驗檢測前列腺癌細胞的侵襲能力，結果表明，MMP-9的表達水平與前列腺癌細胞的侵襲能力呈正相關。本研究表明，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細胞中MMP-9表達水平顯著低于對照組和Z-DEVD-FMK組，且隨著Res劑量增加，MMP-9表達水平顯著降低，呈劑量依賴性，提示Res能夠通過下調MMP-9表達水平抑制PC-3細胞侵襲。

Caspase-3是腫瘤細胞凋亡過程中的關鍵蛋白，Hay等[21]研究表明，重組蛋白IAP可以下調Caspase-3或Caspase-7的表達，阻止細胞凋亡。PARP-1是Caspase-3下游的信號分子，在大量自由基和氧化劑存在的情況下會引發PARP-1過度激活，引起ATP的過度消耗，引發細胞凋亡[22]。本研究以Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK處理的細胞為陽性對照，探究Res對人前列腺癌PC-3細胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平的影響，結果表明，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平顯著高于對照組和Z-DEVD-FMK組，且隨著Res劑量增加，Caspase-3和PARP-1 mRNA表達水平顯著提高，呈劑量依賴性，提示Res通過激活PC-3細胞中Caspase-3和PARP-1的表達來影響PC-3細胞侵襲和凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇能夠上調Caspase-3和PARP的表達，進而誘導前列腺癌細胞凋亡，為前列腺癌的臨床治療提供一定的理論依據。