甜菜堿型兩性離子聚合物的水解及其對抗菌性能影響的研究

劉東立 陳昌林 郎美東

1上海東杰高分子材料有限公司 （上海 201108）2華東理工大學材料科學與工程學院 （上海 200237）

兩性離子聚合物獨特的兩性離子結構使其具有一些獨特的性質[1-3]。一方面，兩性離子聚合物微凝膠具有與蛋白質核酸等生物大分子相似的分子結構，因而具有良好的生物相容性；另一方面，其分子鏈上的酸堿基團之間可以形成離子鍵，與共價鍵相比，屬于弱的相互作用，因此，其對環境的變化更為敏感。

另外，大多數兩性離子聚合物鏈內引入—OH，—COOH，—SO3H及胺基等親水基團，從而具有良好的抗非特異性蛋白質吸附、抗細菌黏附及抗凝血等性能[4]。兩性離子聚合物在分離技術[5]、生物醫用材料[6]、醫療器件[7]、藥物基因載體[8-11]，尤其在高效防生物污損領域有廣泛的應用前景[12]。

聚[2-(甲基丙烯?；趸?乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨 (PDMAPS,也稱PSBMA)和聚[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨 (PDMMPPS,也稱PSPP)是兩類典型的磺酸基甜菜堿型兩性離子聚合物。其兩性離子基團通過酯鍵或酰胺鍵與聚合物主鏈相連，而這些酯鍵或酰胺鍵可水解，水解會使聚合物失去兩性離子基團從而失去兩性離子聚合物的功能性；但二者的水解性能有明顯的差異。由于酯鍵的穩定性比酰胺鍵的穩定性差，所以PDMAPS的穩定性比PDMMPPS差：Pascaline Mary[13]報道了經一次透析提純的PDMAPS的水解率高達13%左右，而帶有酰胺鍵的PDMMPPS只有8%。這說明了無論是PDMAPS還是PDMMPPS，在作為防污抗菌材料應用時，必定會由于水解而失去兩性離子基團，從而使防污效果大大下降，而PDMAPS則更為嚴重，因此，有必要對其水解情況進行進一步的探究。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

1,3-丙磺酸內酯，99%，上海晶純生化科技股份有限公司；蛋白胨（FP318）、酵母粉（LP0021），安琪酵母股份有限公司；大腸桿菌，生物反應器工程國家重點實驗室；乙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（98%）、磷酸二氫鉀（化學純），國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉（99.5%，分析純），上海泰坦科技股份有限公司；過硫酸鉀（分析純）、亞硫酸氫鈉（分析純）、丙酮（99.5%），上海凌峰化學試劑有限公司；[2-(甲基丙烯?；趸?乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨 (DMAPS)、[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨（DMMPPS），99.5%，常州一品堂化學有限公司。

1.2 PDMAPS以及PDMMPPS的制備

稱取單體DMAPS 3 g，溶解于45 mL的0.1 mol/L的NaCl溶液中，加入到100 mL的反應瓶中；分別稱取過硫酸鉀8.1 mg和亞硫酸氫鈉4.05 mg，溶解后加入到反應瓶中；密封后，反復抽氣并通入氬氣，以除去反應瓶中及溶液中的氧氣；置于30℃的條件下反應8 h左右。PDMMPPS的制備方法同上。

1.3 兩性離子聚合物水解實驗

1.3.1 PDMAPS和PDMMPPS在不同pH條件下的水解

稱取PDMAPS及PDMMPPS各1 g，稱量3份，分別溶解于50 mLPBS溶液（磷酸鹽緩沖溶液）、50 mL0.1 mol/L的NaOH溶液 (pH=13)以及50 mL0.1 mol/L的鹽酸溶液(pH=1)中；準備15支干凈的試管，將試管分別編號 A1～A5，B1～B5，C1～C5，然后將50mL聚合物溶液分成5份，每份10 mL，分別裝入ABC編號的試管中，A表示PBS溶液，B表示NaOH溶液，C表示鹽酸溶液；將這15支試管置于37℃的恒溫振蕩箱中振蕩，每隔10 d依次取出編號1,2,3,4,5的樣品，在蒸餾水中透析1 d，冷凍干燥后送核磁檢測。

1.3.2 PDMAPS的常溫透析水解

稱取聚合成功的PDMAPS 2 g，溶解于100 mL0.1 mol/L的NaCl溶液中，配制成0.02 g/mL的聚合物溶液。將聚合物溶液分成2等份，作為平行樣作對比。在室溫(25℃)條件下，將2份50 mL聚合物溶液分別在0.1 mol/L的NaCl溶液中透析（透析袋能透過分子的相對分子質量低于7000），記錄時間，每隔 1 天換一次蒸餾水，分別在第 1，3，6，12，24，48 和96 d取一次樣，每次取樣5mL左右，取出的樣進行冷凍干燥，然后做1H-NMR測試。為防止外界灰塵、空氣等條件的干擾，透析過程盡量在恒溫的密閉條件下進行。

1.3.3 PDMAPS和PDMMPPS在高溫條件下的水解

稱取聚合成功的PDMAPS及PDMMPPS各1 g，溶解于50 mL0.1 mol/L的NaCl溶液中，加入到100 mL的燒瓶中，在80℃條件下冷凝回流3 d，然后在蒸餾水中透析1 d，冷凍干燥后送核磁檢測。

1.4 抗菌測試

培養基配制：將1 g酵母粉，2 g蛋白胨，2 g Na－Cl，4 g瓊脂粉放入錐形瓶中，倒入200 mL去離子水配制成溶液。

培養液配制：將1 g酵母粉，2 g NaCl以及2 g蛋白胨放入錐形瓶中，倒入200 mL去離子水配制成溶液。

無菌水為0.85%的NaCl溶液。

滅菌處理：將做抗菌實驗需要的玻璃儀器洗凈，然后將其和槍頭、離心管（EP管），以及配制好的無菌水、培養液和培養基等放在全自動高壓滅菌鍋中，在115℃下高壓滅菌20 min，取出后放在紫外無菌操作臺上，以防止染上雜菌。

大腸桿菌的培養：取4 mL原菌液，滴入到培養液中，密封，這一過程需在無菌臺上操作；將培養液放置在恒溫振蕩箱中振蕩5 h，得到陰性大腸桿菌菌液。菌液需要檢驗大腸桿菌的濃度，其值不能過高或過低?？梢匀∩倭烤?，稀釋10倍，使用分光光度計測量，吸光度值在0.1～0.2之間比較適宜。

固體培養基的制備：剛滅菌后的高溫液體培養基倒入滅菌后的培養皿中，然后放在紫外無菌操作臺上讓培養皿中的培養基冷卻凝固，凝固后蓋上培養皿蓋倒置以做備用。每個樣品需要使用2個固體培養基做平行樣，本實驗中，有空白對照組，未水解的PDMAPS，12 d常溫透析水解的PDMAPS和96 d常溫透析水解的PDMAPS共4組樣品，所以需要8個培養皿。

抗菌實驗步驟：稱取未水解的PDMAPS，12 d常溫透析水解的PDMAPS和96天常溫透析水解的PDMAPS各120 mg，分別加入到已經滅菌的錐形瓶中，編號1，2，3，空白錐形瓶編號為4；取準備好的陰性大腸桿菌菌液20 mL加入到4個錐形瓶中，待產物溶解后，使用棉紗布將瓶口封住，放入ZQLY-180 T振蕩培養箱中在37.0℃下培養5 h；取100μL菌液在EP管中使用無菌生理鹽水逐步稀釋107倍，再取稀釋107倍后的菌液100μL逐滴滴在固體培養基表面的中心位置，使用涂布棒將大腸桿菌菌液均勻地涂布在固體培養基表面，然后按照樣品的順序進行編號；將編號后的培養皿倒置放入37.4℃的SPX-300B-G型微電腦光照培養箱中培養18 h，然后取出培養皿，拍照并統計大腸桿菌菌落數目。為確保操作過程中不染菌，整個操作在點燃酒精燈的無菌臺上完成，并且需要保證操作過程的規范性。

1.5 測試與分析

采用德國Brucker AVANCE 500超導傅里葉變換核磁共振波譜儀對共聚物進行1H-NMR表征；采用美國Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀，使用KBr壓片法對樣品官能團進行紅外表征；采用北京普立泰科儀器有限公司的PL-GPC 50型DMF相凝膠滲透色譜儀進行GPC表征；采用杭州格圖科技有限公司的BM-18雙目生物顯微鏡對大腸桿菌在薄膜表面的黏附情況進行觀察；采用活菌平板計數法研究薄膜對大腸桿菌的致死率；采用日本理學株式會社的Ultima IV X射線衍射儀進行X射線光電子能譜分析（XPS）。

2 結果與討論

2.1 兩性離子聚合物的制備

PDMAPS和PDMMPPS均為白色塊狀固體，硬而脆，產率為85%，相對分子質量大約為5萬。其化學結構如圖1所示。

圖 1 DMAPS（a）和 DMMPPS（b）的結構式

2.2 兩性離子聚合物的水解

PDMAPS和PDMMPPS均為水溶性兩性離子聚合物，二者核磁共振氫譜分別如圖2和圖3所示。圖2 中化學位移：a(2H,1.7～1.9)，b(3H,0.7～1.1)，c(2H,4.2～4.5)，d(2H,3.6～3.8)，e(6H,3.0～3.2)，f(2H,3.4～3.6)，g(2H,2.1～2.3)，h(2H,2.8～3.0)?？梢酝ㄟ^ b 峰與 e 峰的強弱來判斷聚合物的水解程度。PDMAPS水解前b峰強度與e峰強度之比（b/e）為3∶6，酯鍵水解斷裂并經透析后，e峰削弱，b/e值增大，初始的PDMAPS和水解后b/e值的這種差異可以用來粗略分析其水解率。同理，PDMMPPS也通過這種方法測定水解度?？梢粤頱0=b1=3，則水解率：

式中：b0，e0為未水解 PDMAPS 的 b，e 峰強度；b1，e1為水解后PDMAPS的b,e峰強度。

圖2 PDMAPS的1H-NMR譜圖

圖 3 PDMMPPS 的 1H-NMR 譜圖

通過XPS測定聚合物的元素組成，可以較為精確地分析出聚合物的水解程度。理論上，聚合物中各元素的物質的量比為 n（C）∶n（N）∶n（O)∶n(S)=11∶1∶5∶1，水解之后由于酯鍵的斷裂會導致N，S元素比例的減少，通過分析C元素與N元素或S元素的比值[x（C）/x（N）或 x（C）/x（S）]來確定水解率。因為存在一定的系統誤差使得初始x（C）/x（N）值不能準確地保證在11，所以計算過程中以初始的XPS中顯示的比值為準。計算公式見式（2）。

其中：φ表示水解率；x(C)0，x(C)1表示水解前后C元素的物質的量分數，x(N)0，x(N)1表示水解前后N元素的物質的量分數。

2.2.1 PDMAPS在不同pH條件下的水解結果

在不同pH條件下的水解實驗中，設計有3組不同pH的水解溶液，分別為鹽酸溶液(pH=1)，PBS溶液(pH=7.4)，NaOH溶液(pH=13)。每組有5組不同時間段的樣品，分別為 10，20，30，40 和 50 d。本實驗取了第20 d和第40 d的結果做了核磁共振譜圖，結果如下。

（1） 酸性條件下的水解

圖4反映酸性條件下PDMAPS在第20，40 d時的水解情況。初始PDMAPS核磁共振譜圖（見圖2） 中，e0/b0=2.15，20 d 后 e1/b1=2，40 d 后 e2/b2=1.98。代入公式（1），可得水解率φ1=7.0%，φ2=7.9%。酸性條件下水解結果表明：酯在酸性條件下穩定性較好，存在微弱水解且水解緩慢，40 d后水解率達7.9%。

圖4 PDMAPS在酸性條件下第20，40 d時的水解情況

（2） 中性條件下的水解

圖5反映了中性條件下PDMAPS在第20，40 d時的水解情況。在初始PDMAPS核磁共振譜圖中，e0/b0=2.00，20 d 后 e1/b1=1.99，40 d后 e2/b2=1.94。代入公式（1），可得水解率φ1=0.5%，φ2=3%。中性條件下的水解結果表明：酯在中性條件下穩定性較好，幾乎不怎么水解，水解緩慢，40 d后水解率僅僅達到3%。

（3） 堿性條件下的水解

圖6反映了堿性條件下PDMAPS在第20，40 d時的水解情況。在初始PDMAPS核磁共振譜圖中，e0/b0=2.35，20 d 后 e1/b1=1.66，40 d 后 e2/b2=1.04。代入公式（1），可得水解率 φ1=29.4%，φ2=55.7%。堿性條件下的水解結果表明：酯鍵容易在堿性條件下水解，20 d后達到29.4%，40 d后達到55.7%。

為清楚地表示PDMAPS在不同pH下的水解情況，將核磁結果處理成水解率數據，具體見表1。

圖5 PDMAPS在中性條件下第20,40 d時的水解情況

圖6 PDMAPS在堿性條件下第20,40 d時的水解情況

表1 PDMAPS在不同pH條件下的水解率%

2.2.2 PDMMPPS在不同pH條件下的水解結果

（1） 酸性條件下的水解

圖7反映了酸性條件下PDMMPPS在第20，40 d時的水解情況。初始PDMMPPS核磁共振譜圖（見圖 3） 中，f0/b0=2.22，20 d 后 f1/b1=1.99，40 d 后 f2/b2=1.81。代入公式（1），可得水解率φ1=10.3%%，φ2=18.5%。酸性水解結果表明酰胺鍵在酸性條件下比較容易水解，40 d后水解率能夠達到18.5%。

圖7 PDMMPPS在酸性條件下第20天、40天的水解

（2） 中性條件下的水解

圖8反映了中性條件下PDMMPPS在第20，40 d時的水解情況。初始PDMMPPS核磁共振譜圖中，f0/b0=2.07，20 d后 f1/b1=2.06，40 d后 f2/b2=2.04。代入公式（1），可得水解率φ1=0.5%，φ2=1.4%。中性水解結果表明：酰胺鍵在中性條件下幾乎不水解，40 d后水解率僅約為1.4%。

（3） 堿性條件下的水解

圖9反映了堿性條件下PDMMPPS在第20，40 d時的水解情況。初始PDMMPPS核磁共振譜圖中，f0/b0=2.14，20 d后 f1/b1=2.14，40 d后 f2/b2=2.14。代入公式（1），可得水解率 φ1=0，φ2=0。堿性水解結果表明酰胺鍵在堿性條件下不水解，40 d后聚合物核磁沒有變化。

為清楚地表示PDMMPPS在不同pH條件下的水解情況，將核磁結果處理成水解率數據，見表2。

2.2.3 PDMAPS的常溫透析水解

2.2.3.1 PDMAPS的常溫透析水解核磁分析

為了進一步研究PDMAPS的水解情況和機理，在常溫條件下不斷地換水，除去水解產生的小分子基團，觀察進一步的核磁結果。從透析水解前后的核磁對比圖可以看出，e/b的值逐漸減小，意味著聚合物存在緩慢水解。表3列出了e/b值以及水解率，初始e/b值為2.23。

圖8 PDMMPPS在中性條件下第20,40 d時的水解情況

圖9 PDMMPPS在堿性條件下第20,40 d時的水解情況

表2 PDMMPPS在不同pH條件下的水解率數據%

從表3可以看出隨著小分子基團的除去，水解緩慢進行，說明PDMAPS中的酯鍵也存在一定的水解平衡，當除去水解產物時，平衡被打破，水解反應正向進行，雖然水解較為緩慢，但100 d左右能夠高達21.5%。

表3 PDMAPS在常溫條件下透析水解數據

2.2.3.2 PDMAPS常溫透析水解XPS測試

為了進一步驗證水解結果的可靠性，將透析水解96 d后的樣品與未做水解的樣品進行XPS測試，結果如圖10所示。

圖10 PDMAPS透析水解前后XPS對比圖

從圖10可以看出，C，N，O，S 4種元素的峰均有一定的削弱。這說明聚合物發生了變化，使得支鏈元素減少，由此推斷聚合物發生了水解。4種元素的組成見表4。

表4 PDMAPS透析水解前后的元素組成%

根據公式（2）：按照 x(C)/x(N)值計算得出 t=0.916，水解率φ=21.8%；根據x(C)/x(S)值計算得出t=0.913，水解率φ=20.8%。上述結果均很接近核磁分析的結果（φ=21.5%），說明了數據的可靠性。

2.2.4 PDMAPS和PDMMPPS在高溫條件下的水解

為了進一步研究PDMAPS酯鍵和PDMMPPS酰胺鍵的穩定性，分別將制備好的PDMAPS和PDMMPPS置于80℃、0.1 mol/L的NaCl溶液中冷凝回流3 d，然后除雜透析，冷凍干燥后送核磁分析。圖11和圖12分別表示了PDMAPS和

PDMMPPS水解前后的核磁對照，結果表明：酰胺鍵的熱穩定性強于酯鍵；根據e0/b0=2.03，e1/b1=1.45，推算出PDMAPS的酯鍵水解率φ=28.6%；根據f0/b0=2.11，f1/b1=2.03，推算出PDMMPPS的酰胺鍵水解率φ=3.8%。

圖11 PDMAPS在80℃下水解前后的核磁對照

圖12 PDMMPPS在80℃下水解前后的核磁對照

2.3 PDMAPS在常溫條件下透析水解前后的抗菌性能對比

核磁和XPS結果均顯示PDMAPS在常溫條件下透析存在緩慢水解，為了驗證緩慢的部分水解對其抗菌性能的影響，分別取0，12，96 d時的水解樣品做抗菌實驗，結果如圖13和圖14所示。

結果表明常溫透析時間越長，抗菌效果越差。隨著時間的延長，水解緩慢進行，而抗菌效果變差，說明聚合物中起抗菌效果的基團主要為季銨磺酸鹽，即兩性離子基團，因而隨著水解所致的兩性離子基團的脫落，抗菌效果逐漸減弱。

圖13 透析0 d(a),12 d(b),96 d(c)時PDMAPS的抗菌效果，(d)為空白對照

3 結論

PDMAPS和PDMMPPS 2種兩性離子聚合物分別含有酯鍵和酰胺鍵。本研究表明：酯鍵對堿敏感，在酸中存在一定的水解，而在常溫中性溶液中較為穩定。在常溫透析水解過程中，通過不斷地除去水解產生的小分子，能夠促進水解緩慢進行，雖然水解速率較慢，但在100 d時水解率也可以達到21%左右。這說明酯鍵的水解是一個平衡反應，當除去水解產物小分子時，平衡正向進行；同時解釋了為什么酯鍵對堿更為敏感，因為部分水解的聚合物產生的羧基容易結合OH-，從而阻礙了逆向反應的進行。而酰胺鍵則恰恰相反，對酸更為敏感，在中性乃至堿性條件下幾乎不水解。80℃下的水解結果說明，酰胺鍵通常較為穩定，在高溫條件下水解趨勢也不是很明顯，相比之下，酯鍵的穩定性要差很多。

透析水解的XPS結果是對核磁結果的一個有力佐證，進一步說明了PDMAPS在NaCl溶液中存在緩慢水解?？咕鷮嶒灲Y果直觀地反映了水解之后，隨著酯鍵的斷裂，兩性離子基團脫落，聚合物抗菌能力下降。

圖14 PDMAPS常溫透析水解前后的抗菌條形圖