利用軟骨細胞膜片技術體外構建管狀軟骨組織的實驗研究

劉浥 李丹 殷宗琦 周廣東 曹誼林

臨床上長段氣管缺損因無法直接吻合，需要移植氣管替代物進行修復。目前常用的有3類氣管移植替代物，包括自體組織、異體氣管和人工材料，均存在各自的缺點。因此，長段氣管缺損的修復一直是臨床治療的難題[1-2]。近年來，組織工程技術的快速發展為解決這一難題提供了新思路[3-4]。Macchiarini等[5]報道了世界首個組織工程氣管臨床移植案例，但該報道僅就單個病例進行了初步嘗試，并無后續的應用報道。因此，要將其真正應用于臨床，仍有很多基礎科學問題亟待解決[6-7]，其中最重要的是建立長段氣管缺損修復后長期存活的大型哺乳動物模型，以及構建成熟的大體積的管狀軟骨組織。

目前，聚乙酸（PGA）/聚乳酸（PLA）混合材料是在體內外構建組織工程化軟骨最常用的支架材料之一。我們之前的研究已經證明，將體外構建的軟骨樣組織植入裸鼠皮下后，以軟骨細胞為種子細胞的復合物能成功再生成熟的軟骨樣組織[8-9]，而在具有完整免疫能力的大型哺乳動物體內卻會引起嚴重的炎癥反應，從而影響軟骨組織在大動物體內的構建[10]。為了實現在大型哺乳動物體內構建組織工程軟骨，我們嘗試選擇無支架材料的構建方式[11-13]。我們發現，通過高密度培養，軟骨細胞可以在體外構建出較大體積的軟骨樣復層細胞膜片，膜片的中央部位及周圍都形成了均質的軟骨陷窩樣結構，很好地彌補了PGA/PLA支架材料構建組織工程軟骨存在的缺點。由于軟骨細胞在bFGF存在時[14]，以及在三維空間中互相接觸時均會維持分化現象[15]，該技術對構建軟骨的種子細胞代次要求較低，較高代次的軟骨細胞也可構建出軟骨樣組織，大大降低了對軟骨供區部位帶來的創傷。同時，該方法構建的組織不含支架材料，可以避免非細胞因素在體內引起的炎癥反應，是適用于大動物體內軟骨再生的方法。本研究進一步改進已有的軟骨細胞膜片技術，利用較小體積的羊耳郭軟骨組織作為種子細胞，在體外構建與羊氣管管徑相當的管狀軟骨樣組織，并具備一定的彈性及生物力學強度?，F將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

10 只山羊，雌雄不限，平均體質量（20.0±3） Kg。每只動物的耳軟骨細胞分別用于體外構建2個長段的組織工程管狀軟骨樣組織。依照實驗動物保護指南，所有動物都獲得了人道主義對待。軟骨細胞培養液為含10%胎牛血清、2 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基。軟骨組織培養液為含10%胎牛血清、10 ng/mL轉化生長因子、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基。

主要實驗試劑：10%胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司），0.25%Ⅱ型膠原酶（美國Worthington公司），DMEM培養基（美國Gibco公司）。

1.2 原代細胞的獲取及擴增

每只山羊取約5.0 cm×6.0 cm大小的耳郭軟骨，剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，震蕩消化30 min，PBS沖洗3遍，加入0.25%Ⅱ型膠原酶，震蕩消化7～8 h[14]。獲得的消化液用 100 μm 細胞濾網過濾、離心，去上清液，沉淀的細胞用高糖DMEM重懸。所得細胞按兩種方式接種：①原代細胞以1×104cells/cm2的濃度接種在100 mm培養皿上，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，用軟骨細胞培養液培養，待細胞生長至70%～80%融合時進行傳代[16]；②取一個100 mm培養皿作為基礎皿，其上接種濃度為4×104cells/cm2的原代細胞，每3天軟骨組織培養液換液一次，直至制備軟骨細胞膜片。

1.3 細胞膜片技術構建管狀軟骨樣組織

消化、離心、重懸第4代細胞，以8×105cells/cm2的濃度接種于之前留取的基礎皿上，以軟骨組織培養液培養，隔天換液。體外培養至1～2周時可于培養皿中揭起一100 mm直徑的軟骨細胞膜片（圖1A）。將揭起的膜片包裹于長4 cm、直徑1.6 cm的硅膠管外，其外用無菌尼龍線固定（圖1B）。繼續以軟骨組織培養液培養，隔天換液，直至第6周。

1.4 組織學檢測

體外培養6周時取樣，觀察標本大體外觀及彈性。 然后，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5 μm），HE及藏紅-O染色，用于觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。用免疫組織化學的方法檢測Ⅱ型膠原（軟骨組織特異性細胞外基質）的表達情況，進一步證明構建組織的軟骨表型[17]。

2 結果

2.1 體外構建軟骨細胞膜片及組織工程管狀軟骨的外觀

高代次大量擴增后的軟骨細胞已失去軟骨細胞典型的三角形外觀，但以高密度（8×105cells/cm2）接種于基礎皿上后可以恢復軟骨細胞外觀，于體外培養1～2周后即可形成半透明的復層細胞膜片，具有一定的韌性及強度，可于培養皿中被完整揭起。將其包裹于硅膠支撐管外繼續體外培養塑形，至6周時取出硅膠支撐管，卷起的膜片已融合為完整的白色半透明的管狀組織。該管狀組織管徑與羊氣管實際管徑相當，長度達到4 cm，具有一定的生物力學強度，按壓后管狀軟骨管腔被明顯壓縮，松開后能完全恢復原始管徑大?。▓D1）。

2.2 體外構建組織工程管狀軟骨的組織學特征

組織學證實，體外構建組織的管壁為連續的軟骨樣組織，HE染色及藏紅-O染色均可見大量軟骨細胞外基質和均勻的特異性軟骨陷窩形成，未觀察到支架材料或其他組織表型。Ⅱ型膠原免疫組化進一步證明了所構建的組織為均勻的軟骨組織（圖2）。

圖1 體外培養構建組織大體觀Fig.1 Gross view of constructs after in vitro culture

圖2 體外6周組織學染色（左上角小圖為完整管腔截面）Fig.2 Histological observation after 6 weeks in vitro culture(The upper left corner represents the complete lumen section)

3 討論

從理論上講，組織工程技術可以利用自體細胞預先構建具有特定形狀、一定機械強度和真正生物學功能的氣管組織，以完全避免其他氣管替代物的許多缺點，成為一種真正理想的氣管替代物，結合氣管修復技術，有望實現長段氣管缺損的永久性重建。2013年，我們以組織工程氣管成功地修復了兔氣管缺損，但該方法并未在完全免疫的大型動物模型中實現。大型哺乳動物長段氣管修復失敗的原因很多，核心的問題包括再生穩定的大體積管狀軟骨困難、軟骨體內血管化及上皮化不穩定等，而最為首要的問題就是如何構建穩定的大體積管狀軟骨。

之前的研究是利用軟骨細胞＋PGA/PLA支架進行構建，該技術雖已較成熟，但在大動物體內構建仍然存在困難。主要的問題是①對自體軟骨細胞的需求量大，供區損傷較大。大量研究證實，軟骨細胞在體外擴增過程中容老化，喪失其特征性表型，分泌軟骨特異性細胞外基質的能力明顯下降[18-19]。而以PGA/PLA支架構建軟骨，要求隨著支架材料的降解，種子細胞能快速大量地分泌細胞外基質，所以用于接種PGA/PLA支架的軟骨細胞需要具備軟骨細胞表型及較強的分泌軟骨特異性細胞外基質的能力，故通常選擇第1代細胞，這就要求獲得大量的原代細胞，對供區造成的損傷比較大。②PGA/PLA支架雖然生物相容性好、細胞親和性高，但其酸性降解產物引起的無菌性炎癥會嚴重影響軟骨組織的體內再生[10，16]。在沒有生物反應器的情況下，這種方法用于構建與大型哺乳動物氣管管徑相當的長段軟骨組織并不合適，其中央部位軟骨形成質量較差，嚴重影響再生管狀軟骨的生物力學強度。

本研究利用軟骨細胞膜片技術構建大體積管狀軟骨，針對上述問題進行了改進，以克服目前組織工程管狀軟骨再生技術中的難點。

如前所述，軟骨細胞在體外二維培養體系下擴增培養時，隨著代次增高，逐漸老化，喪失軟骨細胞特征性表型，Ⅱ型膠原分泌量減少，而代表成纖維細胞特征的Ⅰ型膠原分泌會增多[20-21]。本研究在軟骨細胞培養液中加入一定濃度的bFGF，可加快軟骨細胞體外擴增的速度，還可減緩軟骨細胞成纖維細胞化進程，有助于利用較少的原代軟骨細胞擴增出更多代次、更多數量的軟骨細胞，減少對供區的損傷。但是，該培養體系下的軟骨細胞到第2、3代時仍不可避免地逐漸失去軟骨細胞表型，很難在三維支架上分泌大量細胞外基質。而本研究所應用的細胞膜片技術，可使體外擴增的高代次軟骨細胞恢復分泌大量軟骨細胞外基質的能力。首先，我們的前期研究發現，軟骨細胞分泌的基質中含有TGF-β1、IGF-1，能誘導BMSC分化成為軟骨細胞，并維持軟骨細胞表型[22-23]。本研究在軟骨組織培養液中加入TGF-β1，可誘導成纖維細胞化的細胞恢復軟骨細胞表型，具備分泌細胞外基質的能力；其次，有文獻報道成纖維化的軟骨細胞在“細胞堆積”的培養狀態下會出現再分化，重新表達軟骨細胞特征性表型，并分泌特征性的軟骨外基質[24-25]。使用細胞膜片法時，基礎皿中的原代細胞軟骨表型特征明顯，能大量分泌軟骨細胞外基質以及TGF-β1，加之培養體系中加入的TGF-β1，共同促進堆積狀態下的高代次細胞再分化，恢復分泌細胞外基質的能力。通過分泌的大量細胞外基質的鏈接，原始堆積狀態的細胞團，變為一個有三維立體結構、具備一定力學強度的整體[5]。

利用細胞膜片技術可在小型哺乳動物體內再生管狀軟骨組織，但至今沒有成功用于大型哺乳動物模型的報道。我們的前期研究證實，單純的軟骨細胞膜片在大動物體內可以再生軟骨樣組織[26]，但包裹塑形的硅膠管一同植入大動物體內后，植入的軟骨樣組織被大量纖維結締組織替代，這表明內支撐硅膠管在大動物體內也會引起較強的炎癥反應，成為干擾大動物體內管狀軟骨形成的又一重要因素。那么如果能在體外利用此技術構建出大體積的管狀軟骨，不僅可以避免硅膠管對于體內軟骨再生的影響，也可以彌補之前只能在體內再生片狀軟骨組織的不足。前期報道中提出的方法是體外培養4周形成細胞膜片[26]，但這時膜片內軟骨細胞周圍已堆積大量細胞外基質，已形成較為成熟的軟骨樣組織，經硅膠管塑形后，體外再培養4周的過程中細胞不會再繼續大量分泌細胞外基質，所以即使有部分樣本能形成管狀整體，但不同層次的膜片間連接較疏松，多次按壓后很難維持原始的管狀。本研究發現，在體外培養1～2周時堆積的細胞就已互相連接緊密，可以自培養皿上完整揭下一層細胞膜片，這時將膜片包裹硅膠管塑形后體外繼續培養，細胞繼續分泌細胞外基質，可以使多層膜片融合為一個整體，形成具備均勻軟骨陷窩的管狀組織。本研究構建的組織工程管狀軟骨，其管徑與羊氣管實際管徑相當，長度達到4 cm，具有一定的生物力學強度，按壓后管狀軟骨管腔被明顯壓縮，松開后能完全恢復原始管徑大小，組織學證實了體外構建的管狀組織的管壁為連續的軟骨樣組織。

總之，本研究提出的體外構建管狀軟骨的方法，可以縮短體外構建的培養時間，避免支架材料及塑形硅膠管對于軟骨再生的影響，為實現大型哺乳動物體內構建大體積的成熟管狀軟骨提供了很好的技術方法，為最終建立長段氣管缺損長期功能重建的大動物模型奠定了技術基礎和理論依據。