新疆巴州焉耆盆地奶牛布魯氏菌病病原學分離鑒定情況報告

帕提古麗·托乎提，莫合塔爾·阿布力孜，顏成旭，曾澤民*

（1.新疆巴州動物疾病控制與診斷中心，新疆 庫爾勒 841000；2.新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，烏魯木齊 830001）

布魯氏菌病是由布魯氏菌桿菌引起的人畜共患的傳染－變態反應性疾病。本病具有宿主廣泛、傳染性極強、死亡率不高以及感染后根治困難等特點，是危害最大的人畜共患病之一[1]。目前在家畜中牛、羊、豬最常發生布魯氏菌病，亦可感染人，嚴重威脅著人類和動物健康。牛、羊、豬等布魯氏菌病感染病畜的組織、尿、乳、產道分泌物、羊水、胎盤及胎兒等具有傳染性[2]。

為了對新疆巴州地區奶牛布魯氏菌病病原進行分析研究，在焉耆盆地收集奶牛流產胎兒、屠宰病料、陰道分泌物、鮮乳等病料進行布魯氏菌的分離培養，鑒定引起牛布魯氏菌病的菌種及其生物型，確定焉耆盆地引起奶牛感染布魯氏菌的優勢菌種及其生物型。

焉耆盆地的焉耆縣、和靜縣、博湖縣、和碩縣四縣的奶牛血清學監測調查出現布魯氏菌病陽性奶牛的養殖場和散養奶牛戶共收集奶牛流產胎兒57份。按常規布魯氏菌分離培養法進行布魯氏菌分離培養，并對分離出的疑似布魯氏菌的菌株按照國際布魯氏菌鑒定標準進行菌種及其生物型鑒定，研究了該區域奶牛感染布魯氏菌病的優勢菌種及其生物型。研究結果顯示，焉耆盆地奶牛布魯氏菌病的優勢菌種為牛種布魯氏菌生物3型。

1 材料與方法

1.1 布魯氏菌分離培養

從病畜體內組織病料中分離出的布魯氏菌仍是確定布魯氏菌病最可靠的證據。布魯氏菌多寄生于網狀內皮系統，脾臟出菌率最高，肝臟與腎臟次之[3]。

1.2 布魯氏桿菌細菌培養材料的制備

配制布魯氏桿菌細菌培養基：用國標培養布魯氏菌病的普通布魯氏菌培養基；

布魯氏菌Tb噬菌體：中國疾病預防控制中心提供；

布魯氏菌抑菌染料硫堇復紅：巴州動物疾病控制與診斷中心配制；

單相血清A、M、R：中國疾病預防控制中心提供；

布魯氏菌病診斷抗原：由哈爾濱獸醫研究所生產，批號：201007；

布魯氏菌病診斷陽性血清：由哈爾濱獸醫研究所生產，批號：201003。

1.3 布魯氏菌的培養

從流產胎兒組織中分離布魯氏桿菌，取流產胎兒，先用清水把泥土等污物洗凈，然后在3%來蘇爾中浸泡20～30 min，在無菌條件下解剖，分別取肝、脾、腎、淋巴結、胃內容物、肺、心，在無菌條件下接種在布魯氏菌專用固體培養基上，每份樣品各接種2支培養基，置37℃恒溫箱內培養，分大氣環境和CO2環境培養。4～5 d后觀察結果，如未發現布魯氏菌生長，可繼續培養觀察2周。如有可疑細菌生長，可把菌落轉移，48 h純化培養，進行生物型鑒定。

1.4 布魯氏菌的鑒定

布魯氏菌的鑒定，首先要確定可疑菌是否是布魯氏菌，如果是布魯氏菌，再進一步鑒定種和型。

1.4.1 常規確定布魯氏菌屬的方法

布魯氏菌的鑒定，先把分離培養后挑取的可疑菌做革蘭氏染色鏡檢，如具備以下條件，則可初步確定為布魯氏菌。

一是從菌落生長時間和形態觀察：布魯氏菌在普通培養基上不宜生長，在布魯氏菌專用培養基上接種4～5 d或更長時間，培養出來的菌落大小不等，菌落呈濕潤、圓形、稍隆起，菌苔半透明。小球桿菌或小短桿菌，多為單個，很少成雙，鏈狀排列。

二是從血清凝集試驗觀察：布魯氏菌培養物與布魯氏菌血清作凝集試驗（玻片凝集和試管凝集）呈陽性。

1.4.2 布魯氏菌菌種及其生物型鑒定方法

1.4.2.1 初代分離培養時二氧化碳的需求 被檢流產胎兒組織病料接種在培養基上培養，每份樣品培養2個試管，1份放在干燥缸內，里面點燃蠟燭密封，蠟燭滅火可產生5%～10%的二氧化碳，另一份接種樣品培養試管放在普通環境中，37℃培養，分離到布魯氏菌菌株。

1.4.2.2 硫化氫產生量的測定 將待檢菌的48 h培養物接種在瓊脂斜面上，將醋酸鉛濾紙條夾于斜面與管壁之間，使濾紙條和斜面保持平行，以不接觸斜面為易。濾紙條留在管外1～2㎝，置37℃溫箱培養，經2、4、6 d各觀察一次，以毫米計算濾紙條變黑長度，產生中等量的硫化氫，濾紙條變黑部分長度5～8㎜。

1.4.2.3 染料抑菌試驗 將待檢菌48 h培養物接種在pH值6.8的瓊脂平皿上，用蠟筆將平皿分隔呈4～6格，每格接種一株菌，把不同濃度的硫堇、堿性復紅放在每格培養基上。37℃培養，2、4、6 d各觀察一次。如布魯氏菌被抑制則有菌落或菌苔生長。

1.4.2.4 單相特異性血清A、M凝集試驗 玻片凝集試驗：在清潔無油脂玻片上各滴一滴A、M、R血清，在另一端再滴一滴生理鹽水，然后用接種環取少許布魯氏菌培養物，在生理鹽水中研磨制成菌懸液，取菌懸液分別加入A、M、R血清中混勻，在1～2 min出現凝集顆粒為陽性，否則為陰性。試管凝集試驗：將待檢菌制成抗原，然后按試管凝集反應操作程序分別與A、M、R血清做試管凝集反應，觀察A、M、R血清凝集程度的差別。

1.4.2.5 噬菌體裂解試驗 采用傾注法，將增殖菌比濁成每毫升10億菌體，取0.2 mL加到溶化的并50℃～56℃水浴保溫的半固體培養基中，然后傾注到底層為布魯氏菌瓊脂培養基上。待凝固后，將各種稀釋度的細菌體滴至不同位置上，干后放37℃溫箱中培養24～48 h觀察，在觀察中如果在噬菌體處出現透明的噬菌斑即為裂解，否則為不裂解。

1.4.2.6 尿素酶活性試驗 待檢布魯氏菌48 h培養物，用滅菌生理鹽水制成每毫升10億菌體的菌懸液，取1 mL輕輕加到尿素酶培養基上，37℃培養，15 min、30 min，1 h、2 h、6 h和14 h各觀察一次。如培養基由黃變成紅色或紫紅色表示尿素被分解，判定為陽性。

2 結 果

焉耆盆地收集的57份奶牛流產胎兒按常規布魯氏菌分離培養法進行布魯氏菌分離培養，經鑒定分別在焉耆縣收集的奶牛流產胎兒脾臟組織病料培養出來24號1株菌、和靜縣收集的牛流產胎兒肺臟組織病料中分離到14號1株菌、博湖縣收集的奶牛流產胎兒脾臟組織病料中分離到59號1株菌共3株菌株，鑒定出為牛種布魯氏菌生物3型。焉耆縣收集的奶牛流產胎兒肝臟組織病料中分離到的32號1株菌為羊種布魯氏菌生物2型，見表1。研究結果顯示，焉耆盆地奶牛布魯氏菌病的優勢菌種為牛種布魯氏菌生物3型，主要監測出于焉耆盆地的焉耆縣、和靜縣、博湖縣。

3 預防控制措施

奶牛養殖戶人畜共患病防護意識淡薄、牲畜調運頻繁、運輸環節監管困難，對陽性牛撲殺、無害化處理措施不到位等原因病畜持續感染家畜，引起人的布魯氏菌病[6]。為了布魯氏菌病的預防和控制，我們要采取以下有效措施：

表1 奶牛分離菌株布魯氏菌種及其生物型的鑒定標準及鑒定結果

加大宣傳力度。以通俗易懂的防病科普教育，讓廣大養殖戶充分了解布魯氏菌病對人健康的危害，加強對獸醫工作者的技術培訓，提高農牧民養殖戶的自我保護防范能力[7]。

強化衛生、做好消毒管理。養殖場嚴格按衛生要求處理流產物、糞便及污染物，切斷病源傳播途徑。奶牛飼養場的金屬設施設備、圈舍、場地、車輛要定期消毒，注意母畜產前消毒。

定期檢疫凈化，徹底地撲殺陽性畜，消除傳染源，切斷傳播途徑，培育健康牛群[8]。

做好活畜交易市場的管理和檢疫[9]。

運輸檢疫監督對運輸奶牛要嚴把檢疫監督關，在購牛時必須從非疫區健康牛群中選擇[10]。

增加經費投入，確保防控經費到位，使防控撲殺無害化處理工作能夠順利開展[11]。

4 討 論

巴州地區奶牛主要分布于焉耆盆地。我們對焉耆盆地的奶牛布魯氏菌用布魯氏菌常用國際鑒定方法進行分離鑒定。研究結果顯示，焉耆盆地引起奶牛布魯氏菌病的優勢菌種為牛種布魯氏菌生物3型。新疆農業大學對兵團十二師奶牛場布魯氏菌分離菌株用VirB8-PCR方法擴增布魯氏菌的VirB8基因進行鑒定，鑒定出布魯氏菌，同時采用布魯氏菌分子分型PCR方法進一步對分離株鑒定，鑒定出牛種布魯氏菌[4]。隨著各種分子生物學、蛋白和基因工程技術的發展，布魯氏菌的研究不斷深入，其病原學研究必將獲得長足發展[5]。